中国图书资料分类号 R51
本研究根据人型结核杆菌特异性基因序列设计一对引物，用聚合酶链反应(PCR)快速检测脑脊液(CSF)中的结核杆菌，并同时用直接涂片染色法与抗结核抗体检测做对比。
1 材料与方法
1.1 材料 ①标本来源：25例CSF来自本院神经内科，已确诊为结核性脑膜炎的病人，按常规行腰穿刺取CSF，置于－20°C冷冻保存。②引物的设计与合成：根据结核分枝杆菌IS986插入序列而设计一对引物，扩增片段为：245bp。其序列为：
TB1 5’ —CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC-3’
TB2 5’ —GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA-3’
1.2 方法 ①结核杆菌的PCR检测方法。②脑脊液中DNA的提取：脑脊液100μl,9700g，离心10min，去上清，沉淀用TNE缓冲液处理15min，9700g，离心10min，去上清，加50μl裂解液，98°C15min，9700g，离心5min，取上清做模板。③PCR扩增：反应总体积为25μl，10×PCR缓冲液2.5μl,4×dNTP 1.5μl，引物1.2各0.25μl，无菌去离子水9.5μl，模板10μl，Taq DNA聚合酶1 U/μl，以无菌石蜡油30μl覆盖，进入PCR循环，循环参数为：95°C 5min，94°C 1min，58°C 1min，72°C 1min，32个循环，最后72°C延伸5min。④扩增产物的检测：扩增产物15μl，以2%琼脂糖(含EB液)上100V电泳30min，于紫外光下观察结果，出现245bp扩增带者为阳性，未见245bp扩增带为阴性。⑤CSF直接涂片抗酸染色找结核菌：将CSF经9700g离心10min，留沉淀直接涂片，按常规抗酸染色法染色镜检找抗酸杆菌。⑥ELISA检测结核抗体：在包被抗原的小孔内加入待检CSF 50μl，27°C放10min，反应后取出，用重蒸水冲洗2次，拍干，每孔加酶应用液1滴，37°C反应10min后，用重蒸水冲洗5次，拍干，每孔加底物液，置室温5min，观察结果。
2 结 果
应用3种方法对25例结核性脑膜炎患者的CSF同时进行检测，结果：PCR法，阳性21例，阳性率为：84.0%，直接涂片染色法阳性10例，阳性率为：35.0%，ELISA法阳性8例，阳性率为：32.0%。根据结果，PCR法的阳性检出率明显高于直接涂片法和ELISA法。
3 讨 论
近年来，随着分子生物学诊断技术的发展和应用，使结核菌的实验诊断由常规的表型鉴定向基因型诊断发展。PCR技术可在较短的时间内将极微量的DNA片段扩增至百万倍，将PCR技术应用于结核性脑膜炎的快速诊断具有重要的现实意义。
PCR技术作为一种体外基因扩增技术，其特异性取决于引物的合理选择，如引物的保守性和与其它菌株同源性等，都直接关系到实验结果的准确性。本研究根据结核分枝杆菌IS986插入序列而设计一对引物，扩增片段为245bp。对25份已确诊为结核性脑膜炎的病人CSF进行检测，阳性率达84.0%，而直接涂片法和ELISA法的阳性率仅为35.0%和32.0%，PCR法明显高于直接涂片法和ELISA法，而且PCR法具有快速、简便、特异、敏感等特点。并已广泛应用于临床感染性疾病的诊断，对于临床疾病的诊断和治疗具有重要的意义。
①陕西省科技发展研究计划资助项目
作者单位：710032 西安 第四军医大学西京医院