FQ-PCR技术对慢性乙肝患者血清与外周血单个核细胞
HBV-DNA定量的对比分析
陈雪礼 陈晓宇 刘晓峰 梅锦 詹忠明
（九江市第一人民医院检验科 江西省 332000）
摘要 目的：探讨慢性乙肝患者血清和外周血BPMC的HBV-DNA定量间的关系；方法：采用FQ-DNA技术检测90例慢性乙肝患者血清和外周血单个核细胞的HBV-DNA含量；结果： HBeAg 阳性时，血清和PBMC的HBV-DNA阳性率均为100%， HBeAg阴性时，血清HBV-DNA阳性率为60.9%，PBMC阳性率为66.7%。另外当HBeAg(+)、HBV-DNA(+)时，PBMC阳性率为100%，HBeAg(-)、HBV-DNA(+)时，PBMC阳性率为85.7%，HBeAg(-)、HBV-DNA(-)时，PBMC阳性率为48.1%。结论：同时进行HBV-DNA的血清学以及PBMC内检测十分重要，其检测结果在临床上对慢性乙肝患者的病情判断，治疗措施以及治疗效果的评价具有举足轻重的作用。
关键词：HBV-DNA 外周血单个核细胞 慢性乙肝 FQ-PCR
FQ-PCR technology to chronic hepatitis B patient blood serum and Peripheral Blood Mononuclear Cells HBV-DNA quota contrast analysis
CHEN Xueli Chen Xiaoyu LIU Xiaofeng MEI Jin ZHAN Zhongming
(The clinical laboratory in the first people hospital in Jiujiang City JangXi Province 332000)
Abstract Objective: To discuss the relations between the quotas of HBV-DNA in chronic hepatitis B patient blood serum and peripheral blood BPMC; Methods: Using the FQ-DNA technology to examine HBV-DNA contents of blood serum and peripheral blood mononuclear cells from 90 examples chronic hepatitis B patients; Results: When HBeAg positive, the HBV-DNA positive rates in blood serum and PBMC are both 100%.when HBeAg negative, the HBV-DNA positive rate in blood serum is 60.9%,and PBMC is 66.7%. Moreover, when HBeAg(+), HBV-DNA(+),the PBMC positive rate is 100%.When HBeAg(-), HBV-DNA(+),the PBMC positive rate is 85.7%.When HBeAg(-), HBV-DNA(-), the PBMC positive rate is 48.1%. Conclusion: It is very important that examining HBV-DNA in blood serum as well as in PBMC , their examination results play a pivotal role in the judgment on the chronic hepatitis B patient's condition, the remedial measure as well as the appraisal on treatment result.
KEY WORDS：HBV-DNA，peripheral blood mononuclear cells， Chronic hepatitis B，FQ-PCR
外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）是T、B淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞等免疫活性细胞的集合体，这些细胞在机体免疫应答中至关重要。有研究表明，PBMC是HBV肝外的一个重要靶细胞，并认为与乙型肝炎免疫功能以及病毒持续改变有一定关系。因此我们设计了以下试验以说明PBMC和血清HBV-DNA存在的关系进行以下探讨分析。
1、材料和方法
1.1 标本来源
标本均取自本院2003年5月份-2005年8月份的门诊和住院的90例慢性乙肝患者。其中男性61例，女性29例。年龄在15-70岁之间，平均年龄36岁。所有病例都排除患有其他各型肝炎的混合感染。
1.2 方法
1.2.1 仪器和试剂：检测HBV-DNA 的PCR扩增试剂由广州达安公司提供。检测仪为大和FQD-33A型基因扩增仪。乙肝标志物检测试剂购至上海科华生物工程股份有限公司。
1.2.2 乙肝标志物检测： 采用ELISA法，完全按照说明操作。
1.2.3 血清HBV-DNA提取：直接吸取血清50μl，加等量的DNA提取液混匀，100oC沸水浴10min（前后不误差1分钟），转至4oC静置6-8小时，10,000rpm离心5分钟，取上清液5μl做PCR反应。
1.2.4 PBMC分离及HBV-DNA提取：将患者EDTA抗凝全血2ml用生理盐等量稀释，混匀，加入盛有2ml淋巴细胞分离液的离心管中，离心2500r/min，吸取中间层单个核细胞，用Hand’s液将细胞洗涤3次，末次洗涤液保留备检。离心10000r/min，留取沉积物，-20保存。PBMC沉淀和末次洗涤液（50μl）分别加50μl DNA提取液混匀，100oC沸水浴10min（前后不误差1分钟），转至4oC静置6-8小时，10,000rpm离心5分钟，取上清液5μl 做PCR反应。
1.2.5 扩增
将点好样的反应管放入PCR仪上，93oC2分钟预变性，然后按93oC45秒→55oC60秒，反应10个循环，再按93oC30秒→55 oC45秒反应30个循环。每批PCR试验均做阴、阳性对照、临界阳性。
1.3 统计学方法
χ2检验
2、结果
PBMC第四次Hand’s洗涤液试验结果为阴性，表明血浆和洗涤液内没有HBV，同时也排除PBMC细胞外有HBV污染造成假阳性的可能性。
其他统计数据间比较见下面两个表。
慢性乙肝患者血清与PBMC HBV-DNA检测结果比较（表1略）
由上表可知，HBeAg阳性时，血清和PBMC内HBV-DNA阳性率均为100%；HBeAg阴性时，血清和PBMC内HBV-DNA阳性率分别为60.9%、66.7%；两组数据统计学处理，P>0.05，无显著性差异。
PBMC内HBV-DNA含量与血清HBeAg、HBV-DNA关系（表2略）
HBeAg(+)、HBV-DNA(+)与HBeAg(-)、HBV-DNA(+)的PBMC HBV-DNA阳性率比较P＜0.01；HBeAg(+)、HBV-DNA(+)与HBeAg(-)、HBV-DNA(-)阳性率比较P＜0.05；HBeAg(-)、HBV-DNA(+)与HBeAg(-)、HBV-DNA(-)比较P＜0.05
各组间具有显著性差异。
3、讨论
FQ-PCR技术是在常规PCR基础上添加了荧光标记探针，在无特异性PCR发生时，荧光信号不改变；当有特异性PCR扩增时，荧光信号增长。在FQ-PCR过程中，实时检测反应体系中荧光信号的变化，参照阳性梯度标准品，有电脑自动计算出样品起始DNA定量结果。本法整个检测过程在闭管检测，从根本上解决了PCR扩增产物污染和不能定量的问题。
随着分子生物学的发展，乙肝患者的血清学检测已经从两对半来间接反映患者体内病毒是否复制开始转向血清学的HBV-DNA检测。由于乙肝病毒存在着免疫逃逸等现象，因此血清HBV-DNA存在着假阴性现象，给临床治疗带来不便。因此监测外周血单个核细胞的HBV-DNA具有重要意义。
国内外文献报道，HBV-DNA复制与肝病活动有关[1~3]，目前国内主要检测血清HBV-DNA含量来反映慢性乙肝患者体内HBV的复制情况，但HBV除存在与肝脏外还可以存在与PBMC内[4]。HBV-DNA感染PBMC是由靶细胞上的HBV受体与介导，还可以整合到宿主PBMC内并进行表达。
本次实验表明，慢性乙肝患者HBeAg 阳性时，血清和PBMC的HBV-DNA阳性率均为100%，符合高水平的HBeAg是乙肝病毒复制标志的说法[5]。HBeAg阴性时，血清HBV-DNA阳性率为60.9%，PBMC阳性率为66.7%，提示HBeAg阴性时并不意味着传染性或病毒复制消失。另外当HBeAg(+)、HBV-DNA(+)时，PBMC阳性率为100%，HBeAg(-)、HBV-DNA(+)时，PBMC阳性率为85.7%，HBeAg(-)、HBV-DNA(-)时，PBMC阳性率为48.1%。另外，PBMC第四次洗液HBV-DNA检测均为阴性，表明以上数据中测得PBMC的HBV-DNA不受血浆干扰，可以推断出PBMC可独立存在HBV。
综上所述，由于HBV在PBMC内可以复制增值，因此PBMC有可能再次成为HBV在体内传播的载体，成为慢性乙肝病人再次复发的重要原因。通过检测PBMC的HBV-DNA可以间接反应肝细胞感染病毒的情况，PBMC中感染HBV-DNA对持续慢性化及向肝癌转化造成多个负面影响［6、7］。因此，检测PBMC中HBV-DNA其结果在临床上对于乙肝患者的病情判断，避免治疗盲目性。为更进一步了解治疗效果，制定有效的治疗方案，提供了更可靠的依据。
参考文献
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作者简介：陈雪礼，男，1979年2月生，汉族，安徽蚌埠人，毕业于安徽蚌埠医学院医学检验系