北京协和医院检验科 张时民
血细胞分析技术已经进入自动化时代，而具有白细胞五分类或更多分析参数的仪器也普遍的应用于国内各级医院实验室中，为临床诊断和治疗服务。而具有18项参数带有白细胞三分群功能的血细胞分析仪也已经普及进入到基层医院和社区医疗中心，在许多大型医院中已不占主流位置，因此可以说目前在较大医院的检验科，常规血细胞分析仪已经进入全自动化和白细胞五分类的时代。
本文主要介绍全自动血细胞分析仪在白细胞五分类上的原理和散点图分布特点。此类仪器在红细胞、血红蛋白、血小板和计算参数上一般会采用类似的测定原理和计算方法，此类仪器的进展和其功能特点可参考作者撰写的其它文章（见参考文献）。具有白细胞五分类功能的血细胞分析仪器是指通过各种物理和化学技术对白细胞进行分析，以获得外周血液中白细胞的五种常见类型，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞的百分率和绝对值的测定结果，此外还应该具有对出现异常白细胞的提示或初步分类功能。
目前国内外具有开发研制白细胞五分类法仪器的主要为欧美和日本生产厂商，比较著名的欧美厂家有Beckman-Coulter；ABBOTT；Siemens（Bayer）；ABX；日本有Sysmex和Nihon Kohdon。在国内已经有迈瑞（MINDRAY）公司生产几个型号的五分类血细胞分析仪器投入医疗市场。
一 简要发展史
1974年，一种名为HEMALOG D的具有初步白细胞分类功能的白细胞分析仪问世。
1982年，Technicon公司生产了H6000型血液细胞分析仪器，应该是首款具有白细胞五分类能力的仪器。同时代日本日立公司推出图像分析法的白细胞分析仪HITACHI 8200型，仅仅是用于完成白细胞血片分类的仪器，没有其他血细胞计数分析能力。
Technicon 公司1985 年开发了比较成熟的具有白细胞五分类功能的Technicon H1 型血液细胞分析仪，随后升级为H2型和H3型。
COULTER公司在1987 年开发研制其经典VCS技术，并推出持续具有多年影响力的、具有白细胞五分类功能的血液细胞分析仪MAXM 型。
1990年前后，欧洲和日本许多厂家都陆续推出了各种类型的具有白细胞五分类功能的血细胞分析仪器。各厂家设计生产的此类血细胞分析仪，其在白细胞分类技术上原理各不相同，分析测定项目略有不同，且形式多样，结构复杂，试剂种类和成分也趋于复杂。不断改进和升级的新产品使得仪器在白细胞分类技术上更加成熟和可靠。而技术的提高也带来了仪器和消耗品（试剂）价格的增加。
二 仪器原理和散点图特点
1 体积、电导和激光散射原理
这是Beckman－Coulter公司生产的血细胞分析仪所采用的经典分析方法，他集三种物理学检测技术于一体，在细胞处于自然原始的状态下对其进行多参数分析。该方法也称为体积、电导、激光散射血细胞分析法。此技术采用在标本中首先加入红细胞溶血剂溶解掉红细胞，然后加入稳定剂来中和红细胞溶解剂的作用，使白细胞表面、胞浆和细胞体积保持稳定不变。然后应用鞘流技术将细胞推进到流动细胞计数池（Flowcell）中，接受仪器VCS三种技术的检测。
V代表体积（Volume）测量法，是采用经典的库尔特专利技术，用低频电流准确分析细胞体积。体积是区分白细胞亚群的一个重要的参数，它可有效区分体积大小差异显著的淋巴细胞和单核细胞。C代表高频电导性（Conductivity），采用高频电磁探针原理测量细胞内部结构间的差异，也是该公司的专利技术。细胞膜对高频电流具有传导性，当电流通过细胞时，细胞核的化学组份可使电流的传导性产生变化，其变化量可以反映出细胞内含物的信息。该参数可用来区分体积相近而内部性质不同的细胞群体，如淋巴细胞和嗜碱性粒细胞，由于它们的细胞核特性不同而在传导性参数上有所区别。S代表激光散射（Scatter）测量技术，采用氦氖激光源发出的单色激光扫描每个细胞，收集细胞在10°～70°角度内出现的散射光 (MALS)信号。该激光束可穿透细胞，探测细胞内核分叶状况和胞浆中的颗粒情况，提供有关细胞颗粒性的信息，可以区分出颗粒特性不同的细胞群体。例如细胞内颗粒粗的要比颗粒细的散射光更强，因此可以用于区分粒细胞中的嗜中性、嗜酸性和嗜碱性三种细胞。
图1 VCS法的测定原理
仪器将分析每个细胞在V、C、S 三种检测技术上的测量结果，因为不同类别的细胞会在体积、表面特征、内部结构等方面呈现明显的不同。将这些特征性信息被定义到以VCS为三维坐标(分辨率为256×256×256=16,777,216)所形成的立体散点图中，这五类细胞可在三维空间中形成特定的细胞群。通过计算某群细胞数量占白细胞总数的百分比，即可得到五项白细胞分类结果。仪器不仅仅做出对正常白细胞的五项分类结果，给出典型的散点图型，还可以提示许多异常细胞区域的报警。 
VCS技术可通过DF1、DF2、DF3三个散点图将五种类型白细胞明显区分开。三个散点图的纵坐标均定义为细胞体积。DF1为细胞体积和激光散射的直方图，DF2和DF3为细胞体积和高频电导性的直方图，DF3为除去粒细胞群体后显示出淋巴细胞后面的嗜碱性粒细胞图像。
图2 各类白细胞在VCS三维空间中的分布特点 
图3 各类白细胞在散点图中的分布特点
VCS技术是Beckman－Coulter公司开发研制的经典专有方法，到目前为止的各种高档血细胞分析仪均采用该方法对白细胞进行分析。该方法在白细胞分析上尚有特殊能力，例如可以测定和分析中性粒细胞的体积、核浆比例、细胞颗粒特性等参数，也就是将中性粒细胞的VCS三个参数分别给出，用于了解细菌感性疾病与其它疾病的区别。也可对淋巴细胞、单核细胞等均作出其细胞群体的三个技术参数值，是比较有前景的研究内容。
仪器在RBC、PLT、WBC计数上依然采用电阻抗法，血红蛋白仍然采用比色法测定。该公司的五分类法血细胞分析仪先后推出多种类型，如MAXM、STKS、GEN·S、HmX、LH755和最新的LH780等型号，在某些机型还具有网织红细胞分析功能和T淋巴细胞亚群分析功能。
2. 电阻抗、射频和细胞化学技术
日本Sysmex公司系列血细胞分析仪是在国内应用非常广泛的仪器，从三分类法到五分类法的各种型号仪器都有大量用户。其仪器型号种类丰富，功能和测定参数各异，其各种仪器间均有近似的检测原理，但在结合特定的功能以达到不同的分析目的方面，其原理和所用试剂又有不完全相同之处。本文以目前其最高配置的XE-2100型血细胞分析仪为例说明其在白细胞计数和分类方面的原理和特点。
Sysmex XE-2100在白细胞分类上采用半导体激光流式细胞技术结合核酸荧光染色技术进行白细胞计数和分类。半导体激光照射在通过鞘流技术处理的细胞上，可根据每个细胞所产生的三种信号来鉴别细胞类别。前向散射光（FSC）信号可反应细胞体积大小；侧向散射光（SSC）信号可反应细胞的颗粒和细胞核等内含物的信息；侧向荧光（SFL）强度信号则用于分析细胞内脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的含量。
在白细胞分析上主要采用两个通道进行细胞计数和分类，两个通道均采用激光和鞘流进样的方式测定。DIFF通道： STROMATOLYSER-4DL试剂中的表面活性剂可以溶解掉标本中的红细胞和血小板，并在白细胞膜上打出小孔；然后第二种试剂 STROMATOLYSER-4DS中的聚次甲基染料通过这个小孔进入白细胞中，与细胞核的核酸和细胞器结合，在经过波长633nm的激光照射，产生的荧光强度与细胞的核酸含量成正比。STROMATOLYSER -4DL试剂还具有与嗜酸性颗粒特异性结合的能力，可根据侧向散射光信号强度，将嗜酸性粒细胞从中性粒细胞中分离出来。这样可以将中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞清楚的分离开。在DIFF散射图当中可以得到白细胞的四个分群（LMNE）。
WBC/BASO通道是专用作检测嗜碱性粒细胞的通道，因为嗜碱性粒细胞数量非常少，因此必须采用特殊技术处理。STROMATOLYSER –FB是一种酸性试剂，可将红细胞和血小板形成淡影化，将除嗜碱性粒细胞以外的白细胞处理成裸核形态，然后采用前向散射光（FSC）信号和侧向散射光（SSC）信号使嗜碱性粒细胞从其它细胞中分离出来。前向散射光与细胞体积测定相关，侧向散射光与裸核后的细胞结构复杂性有关。在这个通道中可以获得白细胞总数和嗜碱性粒细胞的数量。 
图4 Sysmex XE-2100白细胞分类散点图