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分子生物学技术在临床检验诊断中的应用

日期:2010-06-04 13:52:56 来源:中华检验医学网 点击:

    现代分子生物学是研究生物大分子--核酸及其表达产物蛋白质的结构、功能、遗传、调控、相互关系和相互作用,从分子水平上探讨生命现象的科学,其主要研究对象是核酸(DNA和RNA)和蛋白质。自从1953年Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构以来,分子生物学在短短五十年时间里以超乎想象的速度飞速发展,渗透到医学每一个领域。可以毫不夸张的说,如果没有分子生物学的应用,人类探索生命活动的行为将会寸步难行。
    将分子生物学技术应用到临床检验诊断学,使疾病诊断深入到基因水平,称为基因诊断。基因诊断技术主要包括核酸分子杂交技术、聚合酶链式反应(PCR)技术、基因多态性分析技术、单链构象多态性(SSCP)分析技术、荧光原位杂交染色体分析(FISH)技术、波谱核型分析(SKY)技术、DNA测序技术、基因芯片技术以及蛋白质组技术等,一些先进的分离和检测技术大大促进了上述技术的完善和发展,如毛细管电泳技术(CE)、液质联用技术(LC/MS/MS)、变性高效液相色谱技术(DHPLC)、非荧光遗传标记分析技术等。基因诊断在感染性疾病、遗传性疾病、肿瘤性疾病等的诊断中发挥越来越重要的作用。下面,我们就临床检验诊断中涉及的主要分子生物学技术作一简要介绍。
  1.核酸分子杂交技术
即基因探针技术。利用核酸的变性、复性和碱基互补配对的原理,用已知的探针序列检测样本中是否含有与之配对的核苷酸序列的技术。是临床应用最早的,也是最基础的分子生物学技术,是印迹杂交、基因芯片等技术的基础。不少探针已经商品化。
  2.PCR技术
    PCR技术是一种特异扩增DNA的体外酶促反应,可以短时间扩增出两段已知序列之间的DNA,用于诊断、鉴定、制备探针及基因工程产品开发等,是一项及其有效和实用的技术。由于PCR试验存在一定的假阳性和假阴性问题,导致PCR技术在我国临床诊断中的应用曾一度被叫停,近年来由于改进的PCR技术如巢式PCR(nested PCR)、多重PCR(multiplex PCR) 、荧光PCR技术等在较大程度上增加了该技术的敏感性和特异性,加上卫生部于 2002-01颁发了有关基因扩增检验技术临床应用的法规性文件《临床基因扩增检验试验室管理暂行办法》(卫医发〔2002〕10号 ),要求从事临床基因扩增检验的技术人员必须经过卫生部临床检验中心或授权的省级培训机构的上岗培训,持证上岗,使PCR技术在临床检验诊断中重新发挥其不可替代的作用,PCR已广泛用于核酸的科学研究以及临床疾病的诊断和治疗监测,尤其在感染性疾病诊断方面更有应用价值。
  3.基因多态性分析技术
    在人群中,各个体基因的核苷酸序列会存在一定差异,称为基因多态性。基因多态性位点普遍存在于人的基因组中,并按孟德尔遗传方式遗传。如果在某个家庭中,某一致病基因与特定的多态性片段紧密连锁,就可以用这一多态性片段作为一种“遗传标记”来判断家庭成员或胎儿是否携带有致病基因。目前认为基因多态性是个体的“身份证”;有的虽然不表现疾病,但也许会影响对药物的反应和用药效果。因此,基因多态性分析技术已经广泛应用于群体遗传学研究、疾病连锁分析和关联分析、疾病遗传机制研究、肿瘤易感性研究、个性化用药等诸多方面。遗传学上把基因多态性片段称为遗传标记。遗传标记分析经历第一代限制性酶切片段多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、第二代微卫星DNA(Microsatellite DNA),现已发展到第三代单核苷酸多态性分析(single nucleotide polymorphism, SNP)。下面分别介绍如下:
  3.1限制性酶切片段多态性(RFLP)分析技术
    RFLP是利用限制性内切酶在特定的核苷酸序列切割双链DNA后凝胶电泳分离开不同大小片段,由于不同个体存在核苷酸序列差异导致限制性酶切位点变化从而使酶切片段呈现多态现象。传统的RFLP方法是指基因组DNA经限制性内切酶酶切,电泳分离后再结合Southern 印迹杂交,构建出DNA指纹图,这种方法特异性和敏感性均较高,但操作繁杂。目前结合PCR技术产生PCR-RFLP方法,是检测与特定的酶切位点有关的突变的简便方法。RFLP方法在遗传性疾病诊断、微生物种属分型、肿瘤发病及诊断研究等领域应用广泛。
  3.2 微卫星DNA分析技术
    微卫星DNA(Microsatellite DNA),又称为短小串联重复(Short tandem repeats, STR)或简单重复序列 (Simple repeat sequence, SRS或SSR) ,广泛存在于原核生物和真核生物基因组中,常见的有二、三、四核苷酸重复序列,约占真核生物基因组的 5%,其基本构成单元 (核心序列 )为 1 – 6bp。其中最为常见的是双核苷酸重复即 (CA)n和 (TG)n,人类基因组约有5×104~1×105个 (CA)n重复序列,占 10 %。每个微卫星DNA的核心序列结构相同,重复单位数目约为 10~60次,其长度一般不超过 300bp,多位于基因非编码区、内含子或非翻译区,可存在于Alu序列中或卫星序列中,但在编码序列及外显子中也可找到。微卫星DNA的高度多态性主要来源于串联数目的不同。关于微卫星DNA多态性产生的机制,目前普遍认为是DNA复制过程中滑动或DNA复制和修复时链滑动与互补链碱基错配,导致一个或几个重复单位的缺失或插入。
    微卫星DNA是近年来飞速发展起来的一种新型的DNA高度多态性遗传标记系统,具有种类多分布广泛、高度多态性、杂合性高、重组率低的特点,在群体中变异范围大,构成了丰富的长度多态性,有高度的个体特异性,并遵循孟德尔共显性遗传规律,提供了众多有高度遗传信息的新的多态性标记。这种多态性标记已广泛用于构建人类遗传图谱、法医学亲子鉴定、遗传疾病和肿瘤发生机制的研究、疾病相关基因、疾病连锁基因和易感基因的研究、以及疾病诊断等等。
  3.3单核苷酸多态性分析(SNP)技术
    随着基因组测序工作的进展,日益发现基因组中存在着数量庞大的 SNP。SNP是一种最常见的可遗传变异,在人类DNA多态性中,SNP约占 90 %。 SNP是指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基,其中最少一种在群体中的频率不小于1 %。 SNP分为两种形式,一是基因编码区的 SNP,称为 cSNP;二是遍布于基因组的大量单碱基变异。SNP作为一种碱基的替换,大多数为转换,即一种嘌呤换为另一种嘌呤或一种嘧啶换为另一种嘧啶,转换与颠换之比为 2∶1。研究发现,SNP在人类基因组 CpG序列上出现最频繁,约占全部SNP的25%,而且多为 C→T,原因在于CpG中胞嘧啶残基 (C)是甲基化的,能够自发地脱氨基产生胸腺嘧啶 (T)。因此,SNP与 RFL P和 STR等 DNA标记的主要不同在于:它不再以“长度”的差异作为检测手段,而是直接以序列的差异作为标记。但 SNP单个基因座的多态性很差,只有二态,为此采用多个SNP基因座进行“单倍型” 分析尤显重要。与第 1、2代遗传标记相比,SNP分析具有以下特点:(1 )SNP数量大,分布密集,平均每 1000bp就有1个 SNP。在 PKD基因内部或附近可能会找到许多 SNP,联合用于ADPKD的单倍型诊断;(2 ) SNP比STR扩增更可靠,不会产生假带;(3 )由于 SNP是二态的,易于自动化批量检测,易于计算机分析结果。
    SNP的研究已受到广泛的重视,它已成为实验室和公司争夺的对象,也是人类基因组计划中的一个重要补充和研究热点。用于 RFLP、STR的技术方法,理论上均可用于 SNP的识别和检出。但印迹分析和 PCR方法,如 SSCP、DGGE等,大都需要标记和电泳,费时费力,难于自动化。近年来,采用了微阵列 DNA芯片、飞行质谱分析和变性高效液相层析法等非电泳分型技术,大大加快了SNP检测效率。
    SNP检测已广泛地应用于疾病的连锁分析及关联分析、肿瘤的杂合性缺失研究、疾病遗传机制研究、个性化用药研究等诸多领域。尽管没有人怀疑SNP在搜寻疾病基因方面的价值,但事实却比人们想象的要难得多。首先基因中存在着的重组破坏了SNP和增加疾病风险性的变异之间的联系,使得相关分析变得困难。有研究指出关联分析比典型的家系分析需要的样本要多得多,以便筛除错误的信号。因此只有高速率分析数千个DNA样本的新技术的出现才会使SNP分析变得真正有价值;其次,虽然关联分析对于只有一个基因位点上的缺陷等位基因的鉴定有实用意义,但这种情况又不常见,大约 90 %疾病易感基因有 1 0个以上相关突变存在,而癌症及其它一些疾病则常涉及多个基因。另外,最普遍的SNP也是最古老的,他们可以同时存在于正常人或患者中,这就意味着SNP和基因的关键突变之间的特定联系可能不存在一个特殊的模式,人们很容易错失一个很重要的联系,或者作出一个错误的联系。样本数量也是SNP应用的一个障碍。尽管大部分SNP出现在各种群体中,但是某一种SNP可能只出现在一个亚群中,一些有意义的cSNP也以相当高的比例出现在某一亚群中。所以要搜寻SNP就要尽可能地采用多种多样的大样本。专利问题也限制着SNP技术应用。由于SNP具有的新颖性、实用性和不明确性等特征,使得许多商业公司抢先获得SNP后能够对其申请专利,限制了许多研究者对它们的使用。
  4.单链构象多态性分析(SSCP)技术
    SSCP是一种简便快速的检测DNA或cDNA突变的技术。其技术原理和过程是:将PCR扩增到的待测DNA或cDNA片段变性,成为单链DNA,在一定条件下,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将单链DNA变性。由于单链DNA的空间构象与分子内碱基组成密切相关,一个碱基的差异即可形成不同的构象,不同构象的DNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的泳动速率不同,形成的带型则不同,故能反映出单链DNA片段的多态性。
  5.DNA测序技术
    将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链寡核苷酸,并使其一端为一固定的末端。另一端由于长度不同,成为一系列相差一个碱基的连续末端。在分别含有4种脱氧核酸的反应体系中,寡核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基。将4种反应体系的寡核苷酸产物,在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样于相邻的加样孔进行电泳分离。由于全部可能产生的不同大小寡聚核苷酸都存在于4种反应产物中,从放射自显影后的4种末端寡聚核苷酸梯子形图谱中,就可以直接读出DNA序列。
DNA测序技术使直接检测核苷酸突变成为可能,而不仅仅是基因片段的多态性分析,使临床基因诊断更加精确。常用于探针设计、特异引物合成、基因结构分析等,在遗传病诊断、微生物种属鉴定、肿瘤诊断等领域广泛应用,人类基因组计划就是由于大规模自动化测序技术的发展而顺利完成的。但由于DNA测序方法复杂,一般临床实验室无法进行,有必要时可委托有条件的公司或研究机构进行。
   6.DNA芯片技术
    DNA芯片技术,实际上就是一种大规模集成的固相杂交,是指在固相支持物上原位合成(in situ synthesis)寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面,然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析,得出样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物,所以称为DNA芯片。根据芯片的制备方式可以将其分为两大类:原位合成芯片和DNA微集阵列(DNA microarray)。芯片上固定的探针除了DNA,也可以是cDNA、寡核苷酸或来自基因组的基因片段,且这些探针固化于芯片上形成基因探针阵列。因此,DNA芯片又被称为基因芯片、 cDNA芯片、寡核苷酸阵列等。
    作为新一代基因诊断技术,DNA芯片的突出特点在于快速、高效、敏感、经济,平行化、自动化等,与传统基因诊断技术相比,DNA芯片技术具有明显的优势:①基因诊断的速度显著加快,一般可于30 min内完成。若采用控制电场的方式,杂交时间可缩至1 min甚至数秒钟。②检测效率高,每次可同时检测成百上千个基因序列,使检测过程平行化。③基因诊断的成本降低。④芯片的自动化程度显著提高,通过显微加工技术,将核酸样品的分离、扩增、标记及杂交检测等过程显微安排在同一块芯片内部,构建成缩微芯片实验室。⑤因为是全封闭,避免了交叉感染;且通过控制分子杂交的严谨度,使基因诊断的假阳性率、假阴性率显著降低。
    DNA芯片技术在肿瘤基因表达谱差异研究、基因突变、基因测序、基因多态性分析、微生物筛选鉴定、遗传病产前诊断等方面应用广泛。如感染性疾病是由于病原微生物(病毒、细菌、寄生虫等)侵入机体而引起。目前已经获得一些生物的全部基因序列,包括141种病毒,几种细菌(流感嗜血杆菌、产甲烷球菌、支原体M.genitalium及实验室常用的大肠杆菌等)和一种真核生物(酿酒酵母),且数量还在增长。因此,将一种或几种病原微生物的全部或部分特异的保守序列集成在一块芯片上,可快速、简便地检测出病原体,从而对疾病作出诊断及鉴别诊断。用DNA芯片技术可以快速、简便地搜寻和分析DNA多态性,极大地推动法医生物学的发展。比如将个体SNPs设计在一块DNA芯片上,与样品DNA杂交,即可鉴定基因的差异。人的体型、长相约与500多个基因相关,应用DNA芯片原则上可以揭示人的外貌特征、脸型、长相等,这比一般意义的DNA指纹谱又进了一步。 应用DNA芯片还可以在胚胎早期对胎儿进行遗传病相关基因的监测及产前诊断,为人口优生提供有力保证;而且可以全面监测200多个与环境影响相关的基因,这对生态、环境控制及人口健康有着重要意义。
  7.蛋白质组及分析技术
    随着大量生物体全基因组序列的获得,特别是人类基因组序列草图的完成,基因组学研究重点不可避免地从结构基因组学转向功能基因组学,而蛋白质组学(proteom)正是作为功能基因组研究的重要支柱在上世纪90年代中期应运而生。蛋白质组是指一个基因,一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。蛋白质组学研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体,从而揭示和说明生命活动的基本规律。蛋白质组学可以分为三个领域:①蛋白质的大规模的分离与鉴定,以及它们的表达后修饰;②蛋白水平的差异显示在疾病中的运用;③运用当前的一切手段研究蛋白质与蛋白质之间的相互关系。与基因组相比蛋白质组具有多样性和可变性。对一个机体而言,基因的数目是恒定的,而蛋白质的种类和数目在同一个机体的不同细胞中各不相同,即使同一细胞在不同的时期,不同条件下,其蛋白质表达也不同。虽然可以通过cDNA芯片等方法显示生物体的基因启动状况,但mRNA水平 (包括mRNA的种类和含量 )并不能完全反映出蛋白质的表达。另外从研究手段方面来说,蛋白质研究技术比基因技术相对要复杂和困难,不仅氨基酸残基数量多于核甘酸残基,而且在蛋白质组研究中没有一种方法象PCR那样能迅速扩增目的片段,这样对于丰度低但功能重要的蛋白质很难进行大规模的研究。
    目前,蛋白质组学研究的主要技术包括:双向(二维)聚丙烯酰胺凝胶电泳(结合等电聚焦和IEJK)分离蛋白质,在固相载体上形成蛋白质-多肽图谱,用敏感的方法染色(如银染)并用图像分析电子计算机进行鉴定;将蛋白质点切下,用酶消化,进一步用氨基酸分析、质谱分析等进行鉴定;或结合蛋白质的毛细管电泳,高效液相色谱技术(HPLC)以至蛋白质芯片进行鉴定。
    蛋白质芯片 (protein array)是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新的方法,它类似于基因芯片,是将蛋白质点到固相物质上,然后与要检测的组织或细胞等进行“杂交”,再通过自动化仪器分析得出结果。这里所指的“杂交”是指蛋白与蛋白之间如 (抗体与抗原 )在空间构象上能特异性的相互识别。此方法与传统的研究方法相比具有如下优点:①蛋白质芯片是一种高通量的研究方法,能在一次实验中提供相当大的信息量,使我们能够全面、准确的研究蛋白表达谱,这是传统的蛋白研究方法无法做到的。②蛋白质组芯片的灵敏度高,它可以检测出蛋白样品中微量蛋白的存在,检测水平已达ng级。美国科学家Haab等运用绿色荧光 (green fluorescence)标记抗体微阵列,用红色荧光 (red fluorecence)标记蛋白混和物,并运用计算机识别 (R/G)的信号强弱,来进行检测,检测水平可达到 1ng/ml。③蛋白质芯片具有高度的准确性。
    蛋白质组芯片可用于蛋白质组学研究中的各个领域,具体来说大致可分为三个方面:研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用,筛选新的蛋白质;蛋白质芯片能够用于现在其它方法不能检测到的,如蛋白质-药物、蛋白质-脂质之间的相互作用;蛋白质组芯片还可用于检测蛋白与小分子物质的作用。例如蛋白质与DNA ,RNA分子等。蛋白质芯片的制作是决定其运用的关键因素之一,蛋白质组芯片的制作比当前流行DNA芯片制作要复杂,特别是涉及大量不同种类的蛋白的高效表达与纯化。因此,蛋白质芯片制作存在费时、费力且成本较高等不足,限制了其在临床的应用。
    8.荧光原位杂交染色体分析技术(FISH)
    FISH是上世纪80年代中期发展起来并直到现在仍在不断改进、完善的技术。其基本过程是:首先制成染色体标本,和与所感兴趣的目的基因(或染色体片段)互补的探针,并在探针上标记荧光色素,当探针与染色体标本上的靶序列杂交后,利用荧光显微镜观察荧光信号从而获得染色体核型的信息。此技术具有灵敏度强、背景低、快速等优点,避免了使用稳定性差、暴光时间长、易污染环境的放射性核素,成为细胞遗传学与分子生物学之间沟通的桥梁。这项实用技术不仅可用于基因在染色体上的定位研究,而且可直接用于实验室诊断。例如,应用bcr-abl基因探针进行FISH染色体分析诊断慢性髓系白血病。
近年来FISH技术不断发展,产生了染色体原位抑制(CISS)技术、间期核FISH、引物原位标记或DNA合成(PRINS)技术等,并且发展出多色FISH和多重FISH技术广泛应用于染色体数目和结构畸变及断裂点检测,标志染色体的识别,多个不同基因的染色体定位,物理图谱的制作,基因缺失和扩增的检测等,在肿瘤细胞遗传学分析中发挥了重要作用。
  9.波谱核型分析技术(Spectral karyotyping, SKY)
    传统FISH技术采用的荧光显微术基于荧光色素特异性的光学滤镜进行单强度的荧光检测,因此很难同时获得多个信号用于分析。1996年,Schrock等将傅立叶光谱学、CCD成像技术和光学显微术结合起来,建立了SKY技术,可以在可见光和近红外区的所有位置同时检测样品的发射光谱,从而可利用发射光谱内所有信息进行分析。目前SKY技术可以补充染色体常规显带分析的不足,清楚地说明G显带不能解释的复杂染色体畸变,主要用于肿瘤细胞的遗传学分析,检测复杂的细胞遗传学异常,也可用于比较细胞遗传学的种间进化差异性研究等方面。
  10.分子生物学相关技术的发展及作用
  10.1 毛细管电泳技术(capillary electrophoresis, CE)
    CE是一项迅速发展的分离技术,主要用于生物大分子的分离,如DNA和被十二烷基磺酸钠 (SDS)饱和的蛋白质,是在一根内径25~100μm毛细管内进行的,毛细管中充入交联聚合物,聚合物起到了分子筛的作用,使质量电荷比相同的物质能够按照分子由小到大的顺序流出,从而实现了分离。分辨率高于高效液相色谱,进样量只需 1~50nl,在毛细管上开一检测窗口,直接进行柱上检测,灵敏度较高,而且样品前处理非常简便,适用于大量临床样品的分析。CE有多种分离模式,其中毛细管凝胶电泳已越来越广泛地用于基因诊断、基因治疗等临床分子生物学领域。
    毛细管凝胶电泳与传统的板式或管式凝胶电泳相比,具有以下特点:(1 )分辨率高,因为毛细管电泳可以施加比板式电泳高 10~100倍的场强,毛细管本身已经具有抗对流作用,不必再使用具有抗对流性的凝胶:(2 )分析速度快;(3 )定量更加准确,避免了电泳染色时因时间、温度、染色剂浓度和放置时间不同而产生的误差;(4)灵敏度更高,毛细管电泳为柱上检测,如使用激光诱导荧光检测器,检测限可以提高到10-18到10 –21mol/L;(5)实现自动化操作。能够进行制备性分离是板式凝胶电泳的优点,目前毛细管电泳使用大孔径毛细管和低场强,只可以进行少量制备,这项技术更适合于临床实验室高灵敏度快速分析的要求。
    应用CE对PCR产物进行分析可以克服常规琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法分析速度慢、操作繁琐、定量结果误差大、自动化程度低的缺点,现已广泛应用于病原体、肿瘤和遗传病的基因诊断,如病原体特异基因检测、基因突变检测、DNA序列分析等。
  10.2 液质联用技术(LC/MS/MS)
    在分析仪器行业中,质谱仪(mass spectrometer, MS)是灵敏度最高,对未知化合物的结构分析及定性最准确,要求相应标准样品或对测定化合物的了解最少的定性手段。而高效液相色谱(HPLC)则是分离化合物范围最广、准确度高、对化合物破坏性小的快速分离方法,特别适用于生物提取物的分离。随着电喷雾界面核大气压化学电离界面这两个技术成熟后,HPLC和MS/MS技术才实现成功联用,LC/MS/MS才实现飞速发展,成为科研和临床分析的有力工具。
    将LC/MS/MS应用于基因遗传性代谢紊乱疾病的诊断,可在2分钟内通过检测血液中氨基酸或酰基肉碱水平异常可快速筛选出近30种基因遗传性代谢紊乱疾病,如各种氨基酸代谢失常血症包括胱氨酸尿症、瓜氨酸血症、酪氨酸血症、超苯丙氨酸血症、精氨酸缺乏症、精氨琥珀酸尿症和各种超甲硫氨酸血症;短链核长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症、异戊酸血症、丙酸血症、甲基丙二酸血症、戊二酸血症和其他各种有机酸代谢失常疾病等。另外,LC/MS/MS在多肽、激素、寡核苷酸以及药物成分分析等方面应用广泛。
  10.3 变性高效液相色谱技术(DHPLC)
    变性高效液相色谱 (denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)是一项在单链构象多态性 (SSCP)和变性梯度凝胶电泳 (DGGE)基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术,可自动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。DHPLC检测变异的基本原理:将工作温度 (柱温 )升高使DNA片段开始变性,部分变性的DNA可被较低浓度的乙腈洗脱下来。由于异源双链 (错配的 ) DNA与同源双链DNA的解链特征不同,在相同的部分变性条件下,异源双链因有错配区的存在而更易变性,被色谱柱保留时间短于同源双链,故先被洗脱下来,从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。这一技术最先由Oefner于 1 995年建立,目前全球使用最多也最易操作的是美国transgenomic公司开发的WAVE  核苷酸片段分析系统,它通过一个独特的DNA色谱柱—DNA Sep柱进行核酸片段的分离和分析。
    方法学比较研究表明,DHPLC敏感性和特异性可达 96%~100 %,明显高于常用的DGGE、CCM、CSGE、SSCP等变异检测技术。目前只有基于毛细管电泳技术发展起来的荧光单链构像多态性分析(F-SSCP)在敏感性和特异性方面能与DHPLC相媲美。但PCR引物的设计、PCR方法及条件、分离温度及分离梯度等关键因素也影响DHPLC检测敏感性。目前,该技术在基因突变检测、DNA微卫星鉴定、肿瘤杂合性缺失的检测、RT-PCR的竞争性定量、基因作图、细菌鉴定、DNA片段大小测定及寡核苷酸的分析和纯化等许多基因组研究领域中应用广泛,最近已被进一步应用到mRNA的检测,鉴定差异表达的基因。
  10.3 非荧光标记的遗传标记分析技术
    近年来,美国GENTEON公司采用激光致导的动态荧光检测技术(Dynamic fluorescence),结合多通道毛细管电泳技术,研制出Capella 400型全自动基因分析系统。该仪器采用动态荧光检测技术,彻底消除了传统荧光DNA标记检测的高成本和复杂性,可精确有效到检测未经标记的单链或双链核苷酸。Capella 400系统是全球迄今为止首创的第一台全自动384道毛细管电泳仪,该系统采用专利化学品与一个具有精密光学结构的旋转圆柱状毛细管阵列相组合,同一系统可进行多种核酸的高通量分析,可应用于SNP、STR、RFLP/AFLP分析,寡聚核苷酸片段质量控制分析、PCR产物质量控制分析、基因表达分析、DNA测序等。
  11. 分子生物学技术在临床检验诊断应用中的问题与展望
    21世纪是生命科学的世纪,分子生物学技术为人类探索生命奥秘提供了强有力的工具,大量新理论、新技术不断涌现,推动分子生物学蓬勃发展。由于一些新技术本身还不成熟、方法相对复杂、操作成本相对较高,限制了其在临床检验的常规应用。但从长远来看,随着技术和经济的不断发展,分子生物学技术将以其不可比拟的强大功能逐渐成为临床检验诊断的主要手段,因此,作为检验工作者应该积极学习分子生物学知识,掌握基本理论和基本技能,以便将来能胜任检验临床工作。

(责任编辑:labweb)

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