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Mol Cell:揭示CRISPR/Cas9基因编辑为何有时会遭遇失败

日期:2018-08-07 23:53:48 来源: 生物谷 点击:

在一项新的研究中,来自美国伊利诺伊大学芝加哥分校的研究人员首次描述了为什么CRISPR基因编辑有时无法发挥作用,以及如何让它更加高效地发挥作用。相关研究结果发表在2018年7月5日的Molecular Cell期刊上,论文标题为“Enhanced Bacterial Immunity and Mammalian Genome Editing via RNA-Polymerase-Mediated Dislodging of Cas9 from Double-Strand DNA Breaks”。

图片来自Ryan Clarke, et al.

CRISPR是一种基因编辑工具,它允许科学家们从DNA中切除不需要的基因或遗传物质,有时还允许添加所需的序列或基因。CRISPR使用一种被称作Cas9的酶,Cas9像剪刀一样切除不需要的DNA。一旦在要被去除的双链DNA的任一条链上进行切割,细胞就启动修复从而将被切割的那条DNA链的两端连接在一起,不然细胞就会死亡。

在这项新的研究中,这些研究人员证实当利用CRISPR进行基因编辑遭遇失败(大约在15%的时间发生)时,这通常是由于Cas9蛋白持续地结合到DNA上,这会阻止DNA修复酶进入切割位点。

论文通信作者、伊利诺伊大学芝加哥分校医学院生物化学与分子遗传学副教授Bradley Merrill说,在此之前,人们并不知道为何这个基因编辑过程会随机地遭遇失败。

Merrill说,“我们发现,在Cas9表现差劲的位点上,它仍然与DNA链结合,从而阻止细胞启动修复过程。”他说,这种继续结合的Cas9也无法继续进行额外的DNA切割,从而限制了CRISPR的编辑效率。

Merrill、伊利诺伊大学芝加哥分校研究生Ryan Clarke和他们的同事们也发现在RNA聚合酶不活跃的基因组位点上,Cas9可能也无法有效地发挥作用。

进一步的研究表明引导Cas9仅结合到DNA双链中的一条链会促进Cas9与RNA聚合酶之间的相互作用,从而有助于将无法发挥作用的Cas9转化为一种高效的基因组编辑器。具体而言,他们发现在基因组编辑过程中,Cas9对DNA链的选择保持一致性会迫使RNA聚合酶与Cas9碰撞,从而将Cas9从DNA上撞下来。

Clarke说,“令我感到震惊的是,仅选择一条DNA链而不是另一条DNA链对基因组编辑产生如此强大的影响。揭示这种现象背后的机制有助于我们更好地理解Cas9与基因组的相互作用如何导致某些编辑尝试失败,而且在设计基因组编辑实验时,我们能够从这种理解中获得益处。”

Merrill说,这些研究发现是非常重要的,这是因为在基因组编辑过程中,Cas9和DNA链之间的相互作用已知是一个“限速步骤”。这意味着它是这个基因组编辑过程中最慢的部分;因此,这个步骤发生的变化最有可能影响基因组编辑的总体持续时间。

Merrill说,“如果我们能够减少Cas9与DNA链之间的相互作用时间,这一点我们如今知道如何利用RNA聚合酶加以实现,那么我们就能够减少Cas9的使用量并限制暴露。这意味着我们更有可能限制不良反应或副作用,这对在未来开发出可能影响人类患者的疗法而言是至关重要的。” 

参考资料:

Ryan Clarke, Robert Heler, Matthew S. MacDougall et al. Enhanced Bacterial Immunity and Mammalian Genome Editing via RNA-Polymerase-Mediated Dislodging of Cas9 from Double-Strand DNA Breaks. Molecular Cell, 5 July 2018, 71(1):42–55, doi:10.1016/j.molcel.2018.06.005.

(责任编辑:sgx)

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