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Nat Biotechnol:让gRNA形成发夹结构可提高CRISPR系统的准确性,提高50倍

日期:2019-05-08 23:10:42 来源: 生物谷 点击:

在一项新的研究中,来自美国杜克大学的研究人员开发出一种方法,可将CRISPR基因组编辑技术的准确性平均提高50倍。他们认为它可以很容易地扩展到这种基因编辑技术的不断扩大的其他形式。这种方法给用于识别待编辑的DNA序列的向导RNA(gRNA)添加一条短尾巴。这条增加的尾巴折叠回来进行自我结合,从而产生一把仅由靶DNA序列打开的“锁”。相关研究结果于2019年4月15日在线发表在Nature Biotechnology期刊上,论文标题为“Increasing the specificity of CRISPR systems with engineered RNA secondary structures”。

图片来自Ella Maru。
论文通讯作者、杜克大学生物医学工程副教授Charles Gersbach说,“CRISPR通常是非常准确的,但是也有一些例子表明存在脱靶活性,因此这一领域的广泛兴趣在于提高特异性。然而,到目前为止提出的解决方案不能在不同的CRISPR系统之间轻松转换。”

CRISPR/Cas9是一种被细菌用来靶向切割入侵病毒的DNA的免疫防御系统。虽然第一个版本的经设计用于人体细胞的CRISPR技术源自一种名为酿脓链球菌的细菌,但是更多的细菌物种携带着其他的CRISPR形式。

这个领域的科学家们花了数年时间寻找具有所需特性的新CRISPR系统,并不断将它们添加到CRISPR工具箱中。比如,一些CRISPR系统较小并且能够更好地导入病毒载体中,从而被递送到人细胞中用于基因治疗。但无论每种CRISPR系统的基因编辑能力如何,所有的CRISPR系统都会时不时地产生不必要的基因编辑。

CRISPR系统的一个共同特性是它们使用RNA分子作为向导,靶向结合基因组中的特定DNA序列上。一旦gRNA找到它的互补性基因序列,Cas9酶就像剪刀一样在DNA上进行切割,从而促进基因组序列发生变化。但是,鉴于每个gRNA序列仅有20个核苷酸长,而人类基因组含有大约30亿个碱基对,因此需要进行大量的筛选,并且CRISPR有时会在一两个碱基对不完美匹配的序列上进行错误地编辑。

一种提高CRISPR准确性的方法是需要两个Cas9分子结合到相同DNA序列的相对两侧上,才能实现完整的切割。虽然这种方法有效,但是它会给CRISPR系统增加更多的组件,这会增加这种系统的复杂性并使得它更难以递送到细胞中。

另一种方法是对Cas9蛋白进行基因改造而使得它不那么活跃,这样它不太可能发生擦枪走火。虽然这也显示出有希望的结果,但是这种类型的蛋白质工程是费力的,并且这种努力对于每个CRISPR系统是特异性的。

Gersbach说,“看起来几乎每周都会发现一种新的CRISPR系统,每种系统具有某种独特的性质,使得它对特定的应用非常有用。每当我们发现新的CRISPR蛋白时,对它进行广泛的重新设计使得它具有更好的准确性并不是一种简单的解决方案。”

论文第一作者、Gersbach实验室博士生Dewran Kocak说,“我们专注于一种不会添加更多组件并且对任何类型的CRISPR系统都是通用的的解决方案。所有CRISPR系统的共同点是gRNA,而且这些短RNA更易于设计。”

Gersbach和Kocak的解决方案是将gRNA延长多达20个核苷酸,使得它折叠回来并与它自身的末端结合在一起,从而形成发夹形状。这就产生了一种锁,如果在仔细检查可能遭受切割的DNA序列中,即使只有一个碱基对是错误的,它也很难被解锁。不过,鉴于gRNA更喜欢与DNA而不是自身结合,与DNA的正确结合仍然能够打开这种锁。

Kocak说,“我们能够对这种锁的强度进行微调,使得gRNA在遇到正确匹配的DNA序列时仍能发挥作用。”

在这篇论文中,Kocak和Gersbach发现这种方法可以将来自四种不同细菌菌株的五种不同CRISPR系统对人体细胞的切割准确性提高平均50倍。在一种情形下,这种提高幅度上升到200多倍。

Gersbach说,“这是一种非常简单的想法,尽管Dewran通过开展多年的研究来证实它的工作方式与我们想象的一样。这是一个很好且优雅的解决方案,能够除去脱靶活性。”

接下来,这些研究人员希望看到这种方法可以处理多少种不同的CRISPR变体,并对这种上锁机制的工作原理进行深入的描述,以便观察不同CRISPR变体之间是否存在差异。鉴于这些实验是在体外培养的细胞中进行的,他们迫切希望看到这种方法在实际的动物疾病模型中如何可能提高CRISPR的准确性。

参考资料:

D. Dewran Kocak et al. Increasing the specificity of CRISPR systems with engineered RNA secondary structures. Nature Biotechnology, 2019, doi:10.1038/s41587-019-0095-1.

(责任编辑:sgx)

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