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乙型肝炎病毒耐药基因检测概述

日期:2019-09-29 21:14:47 来源: CMDE 作者:陈慧毅 王嘉欣 何静云 点击:

一、乙型肝炎病毒耐药基因检测的临床意义


WHO相关资料显示,全球感染过乙型肝炎病毒(HBV)的患者超过三分之一,而慢性乙型肝炎患者约有2.4亿,乙肝严重影响着人类的生命健康。HBV是传染性疾病乙型病毒性肝炎的主要病因,感染HBV可引起肝硬化甚至肝细胞癌变。HBV属嗜肝DNA病毒科,为双链DNA病毒,容易发生变异,从而形成不同的基因型。目前已根据HBV核苷酸序列异质性≥8%将其分成A-J 10种基因型[1-2]。在我国北方以C型为主,南方以B型为主,新疆有出现D型。作为常规抗病毒治疗的核苷(酸)类似药物,拉米夫定(LAM)和阿德福韦酯(ADV)等能够有效抑制HBV的复制,然而长期使用会导至耐药的发生,使治疗效果明显下降。随着分子生物学的快速发展,越来越多的分子生物学技术用于HBV的基因分析,从而为乙肝患者的抗病毒治疗提供科学的依据。尽早检测HBV变异,准确判断拉米夫定和阿德福韦酯等治疗后耐药,指导个性化用药,对于提高乙肝治疗成功率具有很重要的价值。


二、乙型肝炎病毒耐药机制以及常见的突变基因位点


HBV基因型耐药是指乙肝病毒出现某种特定的突变,这些特定的突变点导至HBV耐药。其分子机制是:HBV是一种变异较高的病毒,在复制过程必须经过RNA中间体的逆转录复制步骤,但RNA聚合酶和逆转录酶缺乏校正功能,因此在宿主免疫压力和抗病毒药物的选择压力下,其核酸在少数位点上发生突变是一种常见现象。


HBV对核苷(酸)类似物耐药的产生与HBV聚合酶基因变异有关,并且HBV聚合酶基因变异是多位点的,以C区YMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)基序的变异最为重要。拉米夫定(LAM)的主要耐药位点位于C区(rtM204V/I),204位点的蛋氨酸被缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)置换,即rtM204V/I。上述突变直接导至病毒对药物的敏感性降低,被称为原发耐药突变。另外部分突变不直接引起病毒对药物敏感性的下降,但可以恢复原发耐药变异病毒受损的复制力,被称为补偿耐药突变,主要有rtV173L、rtL180M(常与rtM204V共同出现)和rtL80I(常与rtM204I共同出现)[3]。比如,HBV双点突变株如rtM204V/rtL180M,其病毒复制能力强于rtM204I的单点突变株,可能与rtL180M(B区)的变异补偿C区YMDD变异株的复制缺陷有关。而另一种代表药物阿德福韦酯(ADV),其耐药变异位点则主要集中于HBV聚合酶基因B区rtA181T和D区rtN236T位点。


三、乙型肝炎病毒耐药基因检测方法[4-6]


1.PCR产物直接测序:是将HBV基因组的逆转录酶区进行扩增后直接进行测序分析的方法。PCR产物直接测序法可检测已知和可能的未知耐药变异位点,是最常用的基因型耐药检测方法之一。PCR产物直接测序的方法一般作为基因型耐药检测的金标准。该方法的缺点是灵敏性较差,只有当变异株超过HBV准种池的20%时才能被发现。


2.聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP):该方法具有较强的灵敏性,可检测数量占HBV准种池5%的耐药变异株。但是PCR-RFLP只能检测已知、单一位点的变异,对于少数耐药变异位点监测不失为一种简便、快速且廉价的方法。但随着多种核苷(酸)类似物的相继问世和HBV耐药变异位点的不断出现,该方法将难以胜任多位点变异的检测。


3.反向杂交法:基于该技术的INNO-LiPA方法在国外已获准应用于临床检测,目前INNO-LiPA HBV DR v3 可检测包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韦(ETV)与阿德福韦酯(ADV)常见耐药位点。该法可检测变异株占HBV准种池5% ~ 10%的样品,故敏感性较好,但其同样只能检测已知位点变异。


4.实时荧光PCR:该方法操作简便,可检测变异发生率低于10%的耐药变异。仅能检测已知位点。


5.基因芯片:亦称DNA芯片、DNA微阵列,可检测已知变异位点。


6.限制性片段质谱多态性技术:该技术是将PCR-RFLP技术与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术结合,灵敏度高,能够发现数量不足HBV准种池1%的变异株,但其同样仅能检测已知位点变异,且价格昂贵,很难在临床推广应用。


四、目前已上市产品介绍


我国已批准上市的乙型肝炎病毒耐药基因检测试剂盒较多采用荧光PCR法,主要为国产产品,针对的基因突变位点主要是204位点的YMDD→YIDD(550ATG→ATT及550ATG→ATC)与YMDD→YVDD(550ATG→GTG)。还有较少产品能够检测发生在180位点(rtL180M)的基因突变。


五、小结


由于肝细胞中的共价环状闭合DNA持续存在,使得乙肝患者需要长期用药治疗。抗HBV核苷(酸)类药物主要有拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韦(ETV)、阿德福韦酯(ADV)和富马酸替诺福韦酯(TDF),其中前4种已在我国上市。长期使用核苷(酸)类似药物不可避免地导至耐药基因突变,最终病毒恢复复制能力,病情反弹。尽早进行乙肝病毒耐药基因突变的检测,可以及时发现病毒的耐药情况,指导医生合理用药。随着生物检测技术的发展,越来越多的突变位点被发现,为此类产品的技术审评带来挑战。


参考文献:

[1] 白鑫. 乙型肝炎病毒基因型与临床相关性研究进展[J]. 中华传染病杂志,2014,32(8):509-512.

[2] 陈钦艳. 乙型肝炎病毒基因型及其临床意义研究进展[J]. 预防医学论坛,2014,20(1):47-49.

[3] 徐东平. 乙肝病毒耐药的检测方法与临床意义[J]. 解放军医学杂志, 2010, 35(6): 611-613.

[4] Keeffe EB,Dieterich DT,Han SH,et al. A treatment algorithm for the management of chronic hepatitis B virus infection in the United States:2008 update. Clin Gastroenterol Hepatol,2008,6:1315-1341.

[5] Pawlotsky JM,Dusheiko, GHatzakis A,et al. Virologic monitoring of hepatitis B virus therapy in clinical trials and practice:recommendations for a standardized approach. Gastroenterology,2008,134:405-415.

[6] Degertekin B,Lok AS. Monitoring antiviral resistance in patients receiving nucleos(t)ide analog therapies for hepatitis B:which method should be used?J Hepatol,2008,48:892-894.



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