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一文读懂核酸分子诊断三大技术:qPCR、二代测序NGS和数字PCR!

日期:2020-09-14 15:46:47 来源: 体外诊断经营报 点击:

分子诊断是将分子生物学技术应用于疾病诊断的医学分支学科,利用分子生物学技术研究人体内源性或外源性生物分子的存在、结构或表达调控变化,为疾病的预防、预测、诊断、治疗、预后和转归提供信息和决策依据。精准医疗的发展,将持续推动分子诊断的进步。目前常见核酸分子诊断技术涉及三个技术:荧光定量PCR技术(qPCR)、高通量测序技术(NGS)和数字PCR。如何选择,我们作一下简要介绍。

qPCR

在1983年,美国人Mullis发明了聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction, PCR),这一技术将DNA的变性原理以及复性原理加以利用,采用适温延伸、高温变性以及低温复性,让核酸片段实现了体外扩增,可将极微量的目标DNA特异地扩增上百万倍,从而提高对DNA分子的分析和检测,因为PCR有着很高的灵敏度以及特异性,而且简便快速,所以这种技术已经成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高的技术。

qPCR通过荧光染料或荧光特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时监控反应过程。每扩增一条DNA链,就有荧光染料分子结合到双链DNA上或有荧光分子从探针上释放,实现荧光信号的累积。由于荧光积累与PCR产物形成完全同步,可通过软件对荧光积累信息进行分析和计算,获得待测样品模板的初始浓度。但是,qPCR只能够通过标准曲线和标准品进行相对定量,无法做到精准绝对定量。

NGS

基因测序是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段,是分子诊断技术的一项重要分支。虽然分子杂交、分子构象变异或定量PCR技术在近几年已得到了长足的发展,但其对于核酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上,因此对基于特定基因序列检测的分子诊断,核酸测序仍是技术上的金标准。

NGS可以一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。在基因组水平上,NGS可进行从头测序而获得该物种的全长序列,为后续研究奠定基础;对已知参考序列的物种,进行全基因组重测序可检测新的突变位点,发现个体差异的分子基础。在转录组水平上,NGS可进行全转录组测序,开展可变剪接、基因表达差异、新非编码RNA分子发现等研究。

NGS与染色质免疫共沉淀和甲基化DNA免疫共沉淀技术相结合,可检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。NGS功能强大,适合用于探索筛选新的生物标志物,但是实验操作较复杂,数据分析难度较大,检测周期长,成本较高。

数字PCR

数字PCR是新兴起来的一种核酸分子绝对定量技术。该技术可直接获得DNA分子的拷贝数,实现起始样品中核酸分子的绝对定量,且无需标准品或内标。数字PCR已经被广泛应用到医学、生物学等各个领域,如拷贝数变异、突变检测、复杂来源样品中低丰度核酸分子检测、NGS数据验证、miRNA等微小差异表达研究、单细胞基因表达分析等方面,在已知突变的癌症分子标志物的检测、传染病病原体检测、基因组三倍体分析和基因表达分析等领域展现了强大的优势。

总结

在实验过程中,大家会有疑问:选择哪种检测技术才能更好的达到预期结果?通过突变检测限、定量能力、操作简易程度、检测费用、适用场所、发现未知序列等方面进行比较,您或许会有自己的答案。

从上表来看,数字PCR因为灵敏度高、绝对定量、适合于医院操作等优点,在肿瘤液体活检、无创产前筛查、感染性疾病早期诊断等临床检测应用方面具有显著优势。NGS在检测未知序列、未知突变、高通量多位点检测方面是更好的选择,是科研和独立实验室服务的好工具。qPCR适用于较常规的临床分子诊断项目。

总的来看,分子诊断技术的应用不仅深化对疾病发病机制分子生物学的基础研究,而且不断扩大了分子诊断疾病的病种,随着人类基因组计划的完成和蛋白质组计划的启动,分子诊断方法将极大地推动现代检验医学的迅速发展,并通过这些基本技术的衍生、联合产生新的分析方法,从而提高分子诊断的特异性、敏感性和准确性,为临床医学诊断和治疗提供更准确的数据和信息。




(责任编辑:xsq)

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