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历时多年!颜宁/尹航解析了疟原虫己糖转运蛋白分子结构

日期:2020-09-11 15:00:18 来源: iNature 点击:

疟原虫是疟疾的病原体,在血液阶段依靠葡萄糖提供能量。因此,抑制葡萄糖的摄取代表了抗疟药开发的潜在策略。

2020年8月28日,原清华大学颜宁及尹航共同通讯在Cell 在线发表题为“Structural Basis for Blocking Sugar Uptake into the Malaria Parasite Plasmodium falciparum”的研究论文,该研究该研究介绍了疟原虫物种基因组中唯一的己糖转运蛋白PfHT1的晶体结构,与D-葡萄糖复合时的分辨率为2.6Å,与选择性抑制剂C3361的分辨率为3.7Å。尽管两个结构都显示出封闭的构象,但C3361的结合会引起明显的重排,从而导致额外的口袋形成。该抑制剂结合诱导的口袋为PfHT1特异性抑制剂的合理设计提供了机会。在该研究设计的C3361衍生物中,有几个表现出对PfHT1的抑制作用增强以及对恶性疟原虫的细胞效价,对人GLUT1具有极好的选择性。这些发现通过同时靶向PfHT1的正构和变构位点,为下一代抗疟化学疗法的发展提供了概念证明。


综上,该研究针对疟疾耐药性不断增加的现状,通过对底物或抑制剂结合状态下的PfHT1蛋白结构解析,鉴定了新的药物结合位点并设计出一系列高效的“正构-别构”双位点抑制剂。通过抑制疟原虫对葡萄糖的摄取“饿死疟原虫”,这代表着一种新型抗疟药物研发思路,为下一代抗疟药物的研发奠定了基础。


2020年7月17日,颜宁团队在PNAS 在线发表题为“Cryo-EM analysis of a membrane protein embedded in the liposome”的研究论文,该研究以特征明确的AcrB为原型,提出了一种方便的工作流程,用于对嵌入脂质体中的膜蛋白进行冷冻-EM结构分析。结合优化的蛋白脂质体分离,冷冻样品制备和有效的颗粒选择策略,以3.9Å的分辨率获得了嵌入脂质体中的AcrB的三维(3D)重建。该研究方法可广泛应用于具有独特可溶域的膜蛋白的冷冻EM分析,为功能受跨膜电化学梯度或膜曲率影响的整体或外围膜蛋白的冷冻EM分析奠定了基础


2020年6月15日,颜宁及杨洪远共同通讯在Cell 在线发表题为“Structural Basis of Low-pH-Dependent Lysosomal Cholesterol Egress by NPC1 and NPC2”的研究论文,该研究揭示了低pH依赖性胆固醇从NPC2传递到NPC1跨膜(TM)域的分子基础。在pH 8.0时,在纳米光盘和去污剂中分别获得3.6Å和3.0Å分辨率的NPC1类似结构,揭示了连接N端结构域(NTD)和跨膜固醇传感结构域(SSD)的隧道结构;在pH 5.5时,NTD表现出两个构象,表明胆固醇向隧道输送的运动。在通道的膜边界发现了一个假定的胆固醇分子,TM2向SSD上的表面袋形成。最后,在pH 5.5时获得了分辨率为4.0Å的NPC1-NPC2复合物的结构,阐明了胆固醇从NPC2转移到NPC1(NTD)的分子基础。


2020年6月8日,颜宁团队在PNAS 在线发表题为“Employing NaChBac for cryo-EM analysis of toxin action on voltage-gated Na+ channels in nanodisc”的研究论文,该研究介绍在洗涤剂胶束和纳米圆盘中NaChBac的单粒子冷冻电子显微镜(cryo-EM)分析。在两种条件下,NaChBac的构象与潜在灭活的NavAb的构象几乎相同。确定纳米光盘中NaChBac的结构使研究人员能够检查脂质双层中Nav通道的门控修饰剂毒素(GMT)。为了研究哺乳动物Nav通道中的GMT,该研究生成了一个嵌合体,其中Nav1.7的第二个电压感测域中S3和S4区段的细胞外片段替换了NaChBac中的相应序列。此解决方案可实现毒素对接的可视化。因此,NaChBac可以用作膜环境中GMT与Nav通道之间相互作用的结构研究的便捷替代品。


2020年5月13日,颜宁等团队在Nature 在线发表题为”Structural basis for catalysis and substrate specificity of human ACAT1“的研究论文,该研究介绍了人类ACAT1的冷冻电子显微镜结构。每个protomer都由九个跨膜段组成,这些段包围了一个胞质通道和一个在预计的催化位点会聚的跨膜通道。结构指导的突变分析的证据表明,酰基辅酶A通过细胞质通道进入活性位点,而胆固醇可能从侧面通过跨膜通道进入。这种结构和生化特征有助于合理化ACAT1对不饱和酰基链的偏好,并提供对MBOAT家族中酶催化机制的见解

2020年5月13日,颜宁等团队在Nature 在线发表题为”Structure and mechanism of human diacylglycerol O-acyltransferase 1“的研究论文,该研究介绍了人类DGAT1的冷冻电子显微镜结构。每个DGAT1都有9个跨膜螺旋,其中8个形成保守的结构折叠,将其命名为MBOAT折叠。DGAT1中的MBOAT折叠在膜中形成一个中空腔室,该腔室包围着高度保守的催化残留物。该腔室有两个底物,脂肪酰基辅酶A和二酰基甘油的单独入口。 DGAT1可以同型二聚体或同型四聚体形式存在,两种形式具有相似的酶活性。DGAT1的N末端与邻近的protomer相互作用,而这些相互作用是酶促活性所必需的


尽管为根除该疾病付出了数十年的努力,但疟疾在撒哈拉以南非洲和东南亚的热带和亚热带地区仍然是一种普遍的流行病。疟疾是由疟原虫(Plasmodium spp)引起的,这些寄生虫通过蚊子叮咬传播,最致命的形式是恶性疟原虫。尽管过去已开发出用于治疗疟疾的独特的药物,例如氯喹,青蒿素及其衍生物,但已进化出多耐药性疟原虫,因此需要非常规的下一代抗疟疾疗法消除致命疾病的机制。

疟原虫利用葡萄糖作为主要碳源。一种发现抗疟疾药物的潜在策略是在不损害宿主体内相同生理过程的情况下选择性抑制疟原虫对葡萄糖的摄取。恶性疟原虫对葡萄糖的摄取是由己糖转运蛋白PfHT1介导的,后者是PF3D7_0204700的产物,PF3D7_0204700是疟原虫基因组中唯一注释的己糖转运基因。小分子葡萄糖衍生物化合物3361(C3361)对PfHT1的抑制作用可有效抑制在含D-葡萄糖或D-果糖的培养基中培养的恶性疟原虫的生长,表明PfHT1是抗疟药的潜在靶点。

PfHT1(TCDB#:2.A.1.1.24)属于主要促进者超家族(MFS)中的糖“搬运工(SP)”家族。它与人GLUT1(TCDB#:2.A.1.1.28)(红细胞中的主要葡萄糖转运蛋白)分别具有29%和48%的序列同一性和相似性。这种相对较低的序列保守性可以转化为有意义的结构差异,该差异允许对人葡萄糖转运蛋白的PfHT1的选择性抑制。例如,C3361抑制PfHT1和GLUT1的Ki值具有60倍以上的选择性差异,即〜50μM对〜3.3 mM 。尽管如此,PfHT1与其他糖转运蛋白之间的低序列相似性也阻止了可靠的同源性建模,因此需要高分辨率结构来进行相应的抑制剂优化。

作为最广泛和普遍存在的转运蛋白家族,已经在结构上阐明了许多MFS糖转运蛋白,包括大肠杆菌乳糖:H +转运蛋白LacY,木糖:H +转运蛋白XylE,人类葡萄糖转运蛋白GLUT1和GLUT3,以及哺乳动物果糖转运蛋白GLUT5。MFS成员均共享十二个跨膜区段(TM)的核心结构,这些区段折叠成对称相关的氨基(N)和羧基(C)域,其中六个TM进一步排列为“ 3 + 3”反向重复序列。

几年前,研究人员在2.6Å分辨率的D-葡萄糖存在下成功获得了PfHT1的晶体结构,此后一直致力于C3361的复杂结构,该结构最终使用脂质立方相( LCP)在3.7Å分辨率下确定结晶。基于这些结构,该研究设计并优化了在保持选择性的同时显著提高效能的化合物。

该研究介绍了疟原虫物种基因组中唯一的己糖转运蛋白PfHT1的晶体结构,与D-葡萄糖复合时的分辨率为2.6Å,与选择性抑制剂C3361的分辨率为3.7Å。尽管两个结构都显示出封闭的构象,但C3361的结合会引起明显的重排,从而导致额外的口袋形成。该抑制剂结合诱导的口袋为PfHT1特异性抑制剂的合理设计提供了机会。

在该研究设计的C3361衍生物中,有几个表现出对PfHT1的抑制作用增强以及对恶性疟原虫的细胞效价,对人GLUT1具有极好的选择性。这些发现通过同时靶向PfHT1的正构和变构位点,为下一代抗疟化学疗法的发展提供了概念证明。

综上,研究团队针对疟疾耐药性不断增加的现状,通过对底物或抑制剂结合状态下的PfHT1蛋白结构解析,鉴定了新的药物结合位点并设计出一系列高效的“正构-别构”双位点抑制剂。通过抑制疟原虫对葡萄糖的摄取“饿死疟原虫”,这代表着一种新型抗疟药物研发思路,为下一代抗疟药物的研发奠定了基础。

文章的共同通讯作者为原清华大学生命科学学院、医学院、现普林斯顿大学分子生物学系教授颜宁和清华大学药学院教授尹航,共同第一作者为现已毕业的清华大学生命科学学院博士蒋鑫、清华大学生命科学学院博士后袁亚飞、清华大学化学系2016级博士生黄健与清华大学生命科学学院2017级博士生张硕。

本研究历时多年,在此过程中经费来源于清华大学结构生物学高精尖创新中心、生物联合中心、膜生物学国家重点实验室、国家自然科学基金与北京高校卓越青年科学家计划项目的支持,实验受到全球健康药物研发中心(GHDDI)疟疾项目团队、日本SPring-8同步辐射中心、上海同步辐射光源(SSRF)、清华大学蛋白质研究技术中心X射线晶体学平台及清华大学药学技术中心的支持。


参考消息:

10.1016/j.cell.2020.08.015



(责任编辑:tqh)

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