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Anal Chem:开发出高通量荧光测试方法来筛选CRISPR/Cas9抑制剂

日期:2018-09-09 23:56:42 来源: 生物谷 点击:

CRISPR/Cas9基因编辑技术可能有朝一日治疗目前被认为是无法治愈的疾病。负责切除致病性的DNA片段的Cas9蛋白长期留在体内是不安全的。这就是为什么科学家们正在寻找方法来缩短这种蛋白在消除它的靶标后停留在体内的时间。为了这个目的,在一项新的研究中,来自美国桑迪亚国家实验室的研究人员开发出首个同类型的测试方法,它能够廉价地快速准确地筛选数千种分子是否能够有效地关闭这种DNA切割蛋白。相关研究结果近期发表在Analytical Chemistry期刊上,论文标题为“Versatile High-Throughput Fluorescence Assay for Monitoring Cas9 Activity”。

图片来自Analytical Chemistry, doi:10.1021/acs.analchem.8b01155。

DNA切割:我们如今能够观察它

CRISPR/Cas9基因编辑技术是建立在细菌的免疫系统之上的。通过使用一种俗称为CRISPR的系统,细菌能够保存来自入侵病毒的DNA片段。当病毒再次发起攻击时,Cas9蛋白经向导RNA(gRNA)招募后结合、切割和破坏病毒DNA。

科学家们如今能够像分子剪刀那样利用Cas9和gRNA移除发生突变的DNA序列,并能够校正遗传疾病。这为治疗从癌症到遗传疾病(如肌肉萎缩症和囊性纤维化)到病毒感染(如埃博拉病毒)等各种疾病打开了大门。

然而,Cas9在切割它的靶标后在体内停留的时间越长,就越有可能找到并切割不应被切割的类似DNA片段,这可能导致疾病。

找到在Cas9完成它的预定任务后能够关闭它的化学物的第一步是开发发现这些化学物的工具。桑迪亚国家实验室生物化学家Kyle Seamon解释道,他们开发出的这种测试方法将两种化学物放在一个DNA片段的两条相反的链上。在一条DNA链上,这种测试方法添加一个发出光线的荧光团(第一种化学物),而在另一条DNA链上,它添加一个吸收这个荧光团发出的光线的猝灭剂(第二种化学物)。

接下来,这种测试方法添加了一种潜在的Cas9抑制剂。如果这种抑制剂不起作用,那么Cas9将切割这个DNA片段,将这个荧光团与这个猝灭剂分离开来,从而使得这种测试方法在30分钟内发出明亮的光线。如果这种抑制剂有效地发挥作用,那么这种测试方法将不会发光。 不过在这种测试方法能够给出这种最终结果之前,这些研究人员必须添加一种能够导致Cas9从DNA上释放下来的化学物。Seamon说,“Cas9与DNA之间结合得非常紧密,即便DNA已被切割,它也会将切割后的DNA保持在一起。它不会放手。”

由于这个原因,很少有人开发出Cas9测试方法来测试DNA切割,而且也已存在的测试方法并不能够用于高通量应用中。这种新的测试方法一次可筛选一到两种化学物。通过这种方法,这些研究人员迄今为止已能够筛选将近20万种化学物抑制Cas9的能力,并鉴定出6种具有抑制效果的化学物。

继续寻找'关闭开关'

制药行业和农业行业对让基因编辑更安全非常感兴趣,而且世界各地的科学家们正为此采取多种方法。

天然存在的抗CRISPR是小蛋白。然而即便是小蛋白分子也是比较大的,因此如果不借助于单独的化学载体(如纳米颗粒),它们就不能被运送到细胞中进行治疗。鉴于蛋白运送,特别是抗CRISPR运送,是一个重要的生物技术目标,桑迪亚国家实验室的科学家们已集中精力开发能够将大分子运送到细胞中而不会引起任何不良反应的颗粒。

通过以各种方式寻找Cas9抑制剂,这些研究人员希望增加找到无副作用且可在小鼠和人体临床试验中制造和使用的抑制剂的可能性。当前,这些测试方法仅能够在体外的试管中开展。有朝一日,他们希望这些抑制剂将在世界各地的医生办公室中找到,同时开发出简单的治疗方法来治疗之前被认为是无法逆转的疾病。


参考资料:

Kyle J. Seamon, Yooli K. Light, Edwin A. Saada et al. Versatile High-Throughput Fluorescence Assay for Monitoring Cas9 Activity. Analytical Chemistry, 2018, 90(11):6913–6921, doi:10.1021/acs.analchem.8b01155.

(责任编辑:sgx)

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