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检验科生化定标做什么?

日期:2019-11-29 22:09:20 来源:中华检验医学网 作者:赵晴 点击:


作者 | 赵晴

单位 | 云南省昆明市东川区人民医院检验科




一、为什么要进行生化定标?


因为生化分析仪检测的数值是吸光度(A)值,而检验报告单显示的是浓度值(或活力单位)。定标,就是要找出一个参考点,就是一个K值(或F值)。


它是由仪器与试剂状态确定下来的,当我们测定一个标本时,无论是用手工的方法或全自动生化分析仪,测出来的值只是一个吸光度,这个吸光度对我们没有什么意义,我们要把这个吸光度值转化成一个浓度或酶的活性,那就要乘上一个K值(或F值)。


定标,即测定已知浓度(或活力单位)的校准品,根据生化仪测得的吸光度,进行拟合,得到浓度和吸光度之间的关系曲线—校准曲线,将样本+试剂反应的吸光度带入校准曲线,就可以得到浓度。


数据拟合又称曲线拟合,俗称拉曲线,是一种把现有数据透过数学方法来代入一条数式的表示方式。科学和工程问题可以通过诸如采样、实验等方法获得若干离散的数据,根据这些数据,我们往往希望得到一个连续的函数(也就是曲线)或者更加密集的离散方程与已知数据相吻合,这过程就叫做拟合(fitting)。在数值分析中,曲线拟合就是用解析表达式逼近离散数据,即离散数据的公式化[1]



二、定标类型有哪些?


定标类型通常由试剂厂家提供相应参数,下列定标类型以AU5800为例。


1、单个浓度标准品定标:标准类型为AB,如GLU、TP、ALB、UA、UREA等项目检测。计算公式为Y=AX+B,定标时以水作为零点,标准液作为另一点,建立标准曲线。


2、多个浓度标准品定标:定标类型为5AB或6AB,定标品浓度常用倍比稀释梯度递减,如APOA1、APOB、LP(a)、CRP、PA等项目检测。计算公式为样条函数法(spline)。


3、两个浓度标准品定标:定标类型2AB,常用于Hcy、FMN、HDLC、LDLC等项目检测。计算公式为折线法(polygonal)。


4、MB类型因子: 其实就是人工定标的因数,也就是手工输入常数K值。当选择MB定标时常数K必须输入,常用于连续监测法测定酶类,如ALT、AST、ALP、GGT、CK等项目检测。


K值分为计算K值和实测K值,以ALT例:先测定在线性范围内每分钟吸光度的变化(ΔA/min),以U/L代表酶活性浓度时,则可按下式进行计算:


    U/L=△A/min×K==△A/min×Vt×1000/(Lp×ε×Vs)
 
式中Vt:反应总体积(ml);Vs:样品体积(ml);ε:对NADH的毫摩尔吸光系数6.22;1000:将U/ml转换成U/L Lp:比色杯光径(cm)[2]


当条件固定时,从理论上讲Vt、Vs和Lp均为固定值,ε值为常数,所以常数K是恒定的。


常数K值的选择很重要,比值过高虽然测定的线性范围较宽,但重复性差,反之,虽然精密度好,但线性窄。


K值设置的首先发点应是测定酶的判断值或参考值上限,应保证这些值测定的可靠,所以转氨酶的常数K一般在3000左右[3]


实测K值是用含有酶项目的定标液实际测出K值。


三、多长时间定一次标合适?


K值的稳定性主要取决于仪器与试剂,如果仪器与试剂都十分稳定,K值也就稳定。


本科室使用的定标液为试剂厂家随试剂盒配送的单个项目定标液。试剂为开放性试剂,试剂会因新旧试剂混用或载机时间过长,导致试剂空白每天都在变化,所以本科室生化室项目定标明确规定每个项目的定标频率,这样可避免工作人员忙于检测样本,长时间未定标而忽略不易觉察的结果漂移,可减少室内质控失控。


1、速率法项目如ALT、AST、CK等项目大多用水空白定标,水空白定标易操作,每天定一次;


2、室内质控较稳定的的项目如TP、ALB、GLU等项目每周定标一次分天进行。如周一定标TP、ALB、UREA、CREA、UA;周二定标GLU、Fe、Ca、P、CO2。因上述项目需加定标液才可定标,有些定标液还需倍比稀释,如采取每天所有项目定标会导致开机后准备时间过长,不能及时检测样本。


3、室内质控不稳定的项目,如Hcy,采取隔天定标一次,以保证室内质控结果在控。


4、室内质控失控项目排除仪器、质控品、试剂加错等原因外,追加该项目定标。


5、试剂换新批号需追加该项目定标。


6、仪器进行较大的维修、维护与保养或者更换了重要部件,可能影响检测性能,需重新对所有项目定标。


四、定标失败常见原因有哪些?


1、定标所用的比色杯报警错误,比色杯透光率不合格,原因是比色杯有污物附着,如果清洗比色杯后仍然报错,需考虑更换比色杯。


2、添加试剂时未混匀或混匀不足导致定标失败。


3、重复性不好,定标品没有混匀或者试剂稳定性较差,可通过精密度实验排查原因。


4、试剂因载机时间过长细菌繁殖造成污染,常见于HDLC或LDLC试剂污染后会由无色变为明显可见的蓝黑色。污染试剂取出,放入新试剂后重定标。


5、试剂是否放置错误,重新放置正确试剂。


6、定标液是否开瓶时间过长细菌污染造成定标不过或定标不准确。


7、定标液赋值不准确,在实际工作中会遇到个别项目反复定标室内质控仍失控,排除仪器、试剂等因素外,可采取系数校正、对定标液重新赋值等措施纠正为在控,可采取方法如下:


(1)采用酶法测定的项目(ALT、AST、GGT、ALP)可以通过调整其计算因子K来达到目的。新的计算因子K=(质控液靶值/质控实际测量值)*计算因子K(现在的)。改完之后,再重新做质控,看看质控是否在控。


(2)或在设置测试项目参数界面,相关系数(Correlation Factor):利用直线方程Y=AX+B,进行斜率A和截距B的修正,仪器分别默认为1和0,需要修改其中的A值。新的A=(质控液靶值/质控实际测量值)*A(现在的),改完之后再重新做质控,看看质控是否在控。


顾瑛主任技师点评

此文全面阐述了检验科生化定标的意义、相关影响因素及注意事项,条理清楚,可借鉴于实际工作中。







【参考文献】

[1]石振东,刘国庆.实验数据处理与曲线拟合技术.哈尔滨:哈尔滨船舶工程学院出版社,1991.

[2]丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒说明书.中山标佳生物科技有限公司.2017.

[3]全国卫生专业技术资格考试指导.临床医学检验与技术(中级)[M].北京:人民卫生出版社,2007:473.






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