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Cell+Nature | 帕金森病相关LRRK2蛋白的原位结构

日期:2020-09-29 16:24:52 来源: BioArt 点击:

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二大神经退行性疾病,10%的病人具有家族遗传,其中LRRK2突变是家族遗传型PD最常见的突变。LRRK2是286kDa的蛋白质,N端含有重复序列,C端由激酶和GTPase结构域组成,且被蛋白质互作结构域包围。大部分致病性突变都发生在2个催化结构域,都导致LRRK2激酶过度活化【1】。而LRRK2的激酶过度活化在非家族性帕金森患者中也有报告,表明抑制其激酶活性可能对广泛的PD患者有益。然而,LRRK2激酶活性如何在分子和细胞水平上受到调控,LRRK2激酶活性的异常如何导致PD仍不清楚。


LRRK2参与轴突生长、突触形态发生、膜运输、自噬和蛋白质合成等一些细胞过程,并且能磷酸化Rab GTPase的一个亚组,调节其膜定位和功能。野生型LRRK2主要定位于细胞质中,而一些常见的PD突变型则被观察到在微管周围形成丝状结构。N1437H、R1441G/C、Y1699C和I2020T LRRK2突变体的丝状结构形成增强,并在多种细胞类型中形成丝状结构【2】。虽然LRRK2突变体增强的微管结合如何促进其致病性仍有待确定,但抑制LRRK2激酶活性可以导致野生型和突变型蛋白快速可逆地招募到微管。然而,目前缺乏LRRK2的蛋白结构信息,限制了对LRRK2作用机制的研究。


2020年8月11日,来自UCSD的Elizabeth Villa在Cell杂志上发表文The In Situ Structure of Parkinson’s Disease-Linked LRRK2利用光镜-电子显微镜关联技术(CLEM)、原位冷冻电子断层扫描和亚显微图分析技术,解析了致病性LRRK2突变体的14Å结构,即在左手旋螺的微管周围寡聚形成右手双螺旋。利用整合模型技术,进一步确定LRRK2的结构,GTPase和激酶非常接近,GTPase更靠近微管表面,而激酶则暴露在细胞质中;非催化结构域形成2个寡聚界面,突变破坏一个寡聚界面则LRRK2与微管的结合消失。

研究人员首先在HEK293T细胞中表达致病性突变体LRRK2 I2020T(该突变体可自发形成丝状结构),并使用YFP荧光蛋白进行标记,同时使用Taxol稳定微管结构(之前的研究显示Taxol可增加有LRRK2丝状结构的细胞百分比),在细胞原位解析结构。微管是由α-和β-微管蛋白的异二聚体形成,聚合形成极性左旋螺旋阵列,在人类细胞中,通常由13个原丝组成。在原丝束内,大多数被LRRK2修饰的微管相互平行排列,中心到中心的距离为70±18nm,这种角度和距离的规则分布表明致病性LRRK2介导了微管成束。大多数微管要么没有被修饰,要么全被修饰,这两种形式同时存在于相同的细胞区域。有趣的是,除了典型的13个原丝组成的微管,人细胞中出现非典型的11-和12-原丝组成的微管,而去除LRRK2(I2020T)表达则观察不到被修饰的微管束和11/12原丝组成的微管。


利用亚显微图分析LRRK2(I2020T)与微管结合的螺旋排列,发现LRRK2(I2020T)在11-、12-、13-原丝微管周围形成右手双螺旋,右旋LRRK2(I2020T)和左手微管螺旋之间存在对称性不匹配。每转LRRK2(I2020T)原生质体的数量与微管原丝数量相匹配,每转11、12、13个原丝分别有11、12、13个LRRK2(I2020T)原生质体。从12-原丝微管结合的LRRK2中提取出单个原生质亚组分来进行进一步的亚组分分析,得到分辨率为14Å的结构。LRRK2 WD40结构域二聚体形成相邻的甜甜圈形状的巢穴密度图。LRRK2丝状密度显示出两个垂直于微管轴的对称轴,表明具有2个同质相互作用的位置,其中一个通过WD40:WD40作用界面形成Z形原生质二聚化,另一个是通过C端的ROC(COR):COR作用界面形成S形原生质二聚化。利用整合模型结束对LRRK2的S形原生质进行建模分析,其中一个能展示出原生质的亚显微图。ROC(GTPase)结构域靠近微管表面,与LRRK2的ROC结构域足以与tubulin二聚体互作相一致;ROC和激酶结构域非常接近,两个催化结构域间可能有直接作用;激酶结构域在微管的远端,暴露域细胞质。此外,LRR结构域可能介导形成第三种同质相互作用,连接双螺旋的两条链,使其沿着微管有规则的间距分布。最后,研究人员对WD40:WD40作用界面进行突变破坏,发现丝状结构不能形成,表明WD40:WD40同质作用界面对于LRRK2丝状结构的形成是必需的。


总的来说,文章在细胞原位解析了帕金森病相关蛋白LRRK2突变体的结构,阐述了LRRK2突变体如何与微管互作,形成丝状结构,为研究LRRK2在帕金森疾病中作用提供借鉴,同时展示了低温电子断层扫描技术在细胞环境中解析结构模型的能力。


值得注意的是,在Cell文章发表一周后,2020年8月19日,来自UCSD的S. L. Reck-PetersonA. E. Leschziner合作在Nature杂志上发表文章Structure of LRRK2 in Parkinson’s disease and model for microtubule interaction,解析了分辨率为3.5Å的LRRK2 N端部分的催化结构,并结合本文报道的14Å 原位低温电子断层扫描结构构建出LRRK2相关的微管原子模型。LRRK2激酶结构域的构象可调节其与微管的互作,闭合的构象有利于微管的寡聚。LRRK2的N端催化结构对于原丝形成是充分条件,并在体外阻断微管马达的运动;使用激酶抑制剂让LRRK2 N端结构保持开放状态则减轻这种干扰,减少原丝形成,而稳定闭合构象的抑制剂不行。综合来讲,LRRK2可作为微管马达蛋白的路障(roadblock ),或为治疗性LRRK2激酶抑制剂的设计提供借鉴意义。


原文链接:
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.004
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2673-2


(责任编辑:tqh)

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