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血培养检测规范化操作

日期:2018-08-09 01:09:31 来源:中华检验医学网 点击:

 血培养检测  采血指征:

    对入院的危重患者未进行系统性抗生素治疗前,应及时进行血液培养,患者出现以下体征时可作为采集血培养的重要指征:

1. 发热(≥38℃)或低温(≤36℃)。
2. 寒战。
3. 白细胞增多(>10×10  9/L,特别有“核左移”未成熟的或带状的白细胞增多。
4. 粒细胞减少(成熟的多核白细胞<1×10  9/L)。
5. 血小板减少。
6. 皮肤粘膜出血。
7. 昏迷。
8. 多器官衰竭。
        
     或同时具备上述几种体征时应采血培养。在评估可疑新生儿败血症时,除发热或低烧外,很少培养出细菌,应该补充尿液和脑脊液培养。肺炎链球菌与流感嗜血杆菌菌血症的患儿(特别是2岁以下的幼儿)一般多见于门诊,常伴有明显发热(≥38.5℃)和白细胞增多(≥20×109/L)。老年菌血症患者,可能不发热或不低热,如伴有身体不适,肌痛或中风可能是感染性心内膜炎的重要指征。

    血培养检测  皮肤消毒程序:

     血培养为防止皮肤寄生菌污染,可使用消毒剂(碘酊或碘伏)对皮肤进行严格仔细的消毒处理,最大限度地减低皮肤污染。感染性心内膜炎,特别是心脏瓣膜修复术的感染,可能由皮肤寄生的微生物引起(例如:表皮葡萄球菌或棒杆菌属)。因此,在采集过程中血培养的污染一定要减小至最低程度。用做培养的血液均不应该在静脉或动脉的导管中抽取,除非静脉穿刺无法得到血液或用来评价与导管感染相关性指标。如果抽取了导管血,也应同时在其他部位穿刺获取非导管内静脉血液进行血培养。

     皮肤消毒严格按以下步骤进行:

1. 首先用70%酒精擦拭静脉穿刺部位待30秒钟以上。
2. 然后用一根碘酊或碘伏棉签消毒皮肤(1%-2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒),从穿刺点向外以1.5cm~2cm直径画圈进行消毒。
3. 最后用70%酒精脱碘。
严格执行三步消毒后,可行静脉穿刺采血。注意对碘过敏的患者,只能用70%酒精消毒,消毒60秒钟,待穿刺部位酒精挥发干燥后穿刺采血。

     血培养检测  培养瓶消毒程序:

1. 用70%酒精或碘溶液(不要使用碘)消毒血培养瓶橡皮塞子。
2. 酒精作用待60秒。
3. 在血液注入血培养瓶之前,用无菌纱布清除橡皮塞子表面剩余的酒精,然后注入血液。

     要点:血培养的关键是防止皮肤寄生菌或环境引起的污染,由污染菌引起的假阳性增加了患者抗生素的使用量,延长了住院日,延误病情诊断并增加了经济负担等。然而,在理想的消毒条件下,仍有3%~5%血培养中混有污染菌,它们来源于皮肤(表皮葡萄球菌,痤疮丙酸杆菌,梭杆菌属,类白喉群)或来源于环境(革兰阳性芽孢杆菌属,不动杆菌属),这些微生物有时有致病作用。对两次不同部位血培养生长同一种微生物,不同类无菌部位标本培养中生长同一种微生物,微生物快速生长(48h内)。上述情况下,应考虑是真正的感染。临床实验室工作人员和医生之间应经常讨论血培养结果,建立良好的交流关系对各方面都有益处。例如查病例回顾性调查分析:1995~1999年血中分离的70例凝固酶阴性葡萄球菌,入院48h内检出者,39.3%(24例)为污染菌,48h后检出者(9例)100%为污染菌,污染菌检出时间显著长于病原菌。提示血培养中凝固酶阴性葡萄球菌污染率较高。因此,采血前严格执行皮肤消毒程序非常重要。

     血培养检测  采血量:

     对从菌血症或真菌菌血症患者血培养中获得微生物,每个培养瓶抽取的血量是唯一重要的变量。当培养的血量从2ml增加到20ml时,血培养的阳性率增加30%~50%,因为培养的血液量增加1ml,阳性率增加3%~5%。
用静脉穿刺获得的血量,成人和儿童不同。儿童,特别是新生儿很难获得大量的血液,对婴幼儿和儿童,一般静脉采血1ml~5ml用于血培养,当细菌浓度足够高时,血液少于1ml也足以检测菌血症。标本量大于1ml,细菌量也增加,对于感染的儿童没毫升血液比成人有更多的微生物。对于成人血培养的标本量少于10  ml不易培养出细菌,每瓶最低限量应是10ml血液,20ml~30ml最合适,血液和肉汤的比一般推荐为1:5至1:10。几乎所有现代的血培养系统假如血液量均在10ml以上。虽然静脉采血30ml可增加细菌量,但这不太切合实际,这很容易造成医院获得性贫血。

     血培养的数量和采血时间:

      血培养的数量和采血时间关系到菌血症的病理生理学,一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视为单次血培养。研究已经证实,采集适量的血液注入2~3瓶血培养瓶中足以检测所有的菌血症和真菌菌血症。对间歇性菌血症,用于培养的血液应在估计寒战或体温高峰到来之前采集,因为细菌流入血液与寒战发作通常间隔1h,在发烧时血液可能没有细菌,实际上,血培养通常是在寒战或发烧后进行。由于细菌很快会从血液中清除,因此,在寒战或发烧后应尽快抽取血培养。正是由于这个原因,我们一般不推荐在任意时间抽取静脉血进行培养,研究资料表明任意时间采血并不能提高微生物的检出率。实际上已经证明在24h内同一时间或任意时间抽血培养发现微生物的结果相似。无论何时,采集血培养应该在使用抗生素之前进行,推荐同时采集2~3瓶,每瓶20ml~30ml血样进行培养来做最初的平谷,这也更切合实际。先前饿抗生素治疗可能导致血培养结果阴性,微生物延迟生长更为常见。

     有研究证实,对链球菌心内膜炎患者,在做血培养的前两周内患者接受了抗生素治疗,血培养的阳性率从97%下降到91%。由于有很好的血培养技术,对感染性心内膜炎患者血培养的阳性率应该达到95%以上。

      对特殊的全身性和局部感染患者采集血培养的建议:
1. 怀疑记性原发性菌血症、真菌菌血症、脑膜炎、骨髓炎、关节炎或肺炎的患者:应立即采集2或3份血培养瓶,快速进行血培养。
2. 不明病源的发热,如隐性脓肿,伤寒热和波浪热:发热开始采集2或3份血培养。24h至36h后,估计温度升高之前(通常在下午)立即采集2份以上血培养。
3. 怀疑菌血症或真菌菌血症,血培养结果持续阴性,应改变学培养方法,以便获得罕见的或苛养的微生物。
4. 感染性心内膜炎,对急性心内膜炎患者1h(2h内)采集3份血培养,如果所有结果24h后阴性,再采集3份血培养瓶。入院前两周内接受抗生素治疗的患者,连续三天采集血培养,每天2份。

      要点:大部分临床医生对成年患者采集血量不足,采集血培养份数不够,采血时机不合适,通常在患者体温高热时,24h内采集一瓶血培养,降低了血培养的阳性率,不符合才学的基本规程,实验室应该做大量宣传沟通工作。

     血培养检测  运输标准:

     采血后血培养瓶或采集管应立即送到临床微生物实验室。血培养瓶和采集管短期内置于室温不影响细菌检出,不要冷藏,如果血培养瓶在送往实验室培养或自动化仪器检测之前不得已需放置一段时间,应置于35℃~37℃孵箱中。但含血液的采集管不应置于孵箱中,若有细菌生长会释放出一些气体,采集管有破裂或渗漏的危险。实验室收到血培养瓶后立即进行肉眼观察微生物生长情况。

     采用自动化连续检测血培养系统,有一点很让人忧虑,那就是标本运送有时被延误,这样会导致微生物检测延迟(尽管微生物生长不受影响),目前很少有人注重这一点。尽管自动化连续检测系统有允许延迟上瓶检测微生物生长的原理,培养瓶在运送过程中还应尽量减少延迟。

     血培养检测  接受标准:

     实验室收到血培养后,应按以下步骤操作:
1. 检查培养瓶确保它们被安全地放置。
2. 用肉眼观查微生物生长的情况,注意血液层上面是否有絮状沉淀、均匀的或表面下的浑浊、溶血、液体培养基凝固、有一层表面薄膜、产生气体、血层表面或深层有白色颗粒等,如有上述情况产生提示有微生物生长。
3. 检查瓶子上的标签,确认资料是否齐全,与申请单上的患者资料是否一致。
4. 保证获得适量的血液。
5. 检查血液是否超过要求的基线。
6. 放置在孵箱中或上机进行检测。

     由于菌血症和真菌菌血症的检测对临床感染性基本的诊断十分重要,实验室工作人员应认真接收血标本,对儿童和承认,不管抽血量多少,均应该进行培养并在报告单上注明血量,有可能延误菌血症或真菌菌血症的检测。


    血培养检测  不规范处理方法:

     送到实验室的血标本应认真处理,减少标本错误和标本污染。标本处理不当及不正确采集,医院及实验室工作人员本身携带的病菌均可能造成标本污染。因此,建议发生下列不规范的血培养时应该及时处理。

1. 血培养或培养管无标签或贴错标签、培养瓶或培养管有渗漏、破裂或明显的污染、血标本采集后放置12h以上、用不适当的培养瓶或培养管收集标本。
处理方法:立即与临床医师联系,报告:“标本不规范的具体理由”。
2. 用失效的培养瓶或培养管收集标本。]
处理方法:与医生联系,报告:“用过期培养瓶收集血标本,请用效期内的培养瓶收集标本并送检。
3. 送交血标本的量不足或只送一瓶血培养。
处理方法:与医生联系,报告:“送交的血培养标本量不足,请补送足量血液培养瓶”。
4. 未送推荐的培养瓶数或类型
处理方法:与医生联系,报告:如“只送需氧瓶不符合规程,血培养的基本规程推荐送两种培养瓶:需氧瓶和厌氧瓶”。

     要点:每位临床医师都应该对患者负责任,实验室工作人员发现不规范的血标本后,应该即使同志临床医生以便重复采集血培养进行补救。

     血培养检测  微生物室处理血培养预防感染的安全程序:

1. 细菌室工作人员,在所有的血培养处理过程中都应戴乳胶手套。
2. 拒收不符合安全标准的血培养瓶或培养管。
3. 在生物安全柜内打开或穿刺培养瓶或家一个胶膜防护装置(如:把培养瓶置于丙烯酸酯膜后或戴上口面罩)。
4. 在生物安全柜内操作肉眼观察有微生物生长迹象的培养瓶。
5. 操作产生的气溶胶,可能含有高浓度的致病菌或真菌,利用实验室的方法和技术采取正确的自我保护措施。
6. 用于培养基的塞子和胶带可能含有高浓度的致病菌,应防止接触。
7. 正确处理与血培养有关的污染物。
8. 立即报告血培养结果及抗生素敏感试验结果。

     血培养检测——阳性结果的处理:

     传统手工法血培养应该每天至少检查一次,对48h~72h未生长的培养瓶至少应进行需氧传种培养一次。对培养瓶进行肉眼检查,注意下列几点提示有微生物生长:
1. 血与肉汤混合物出现浑浊。
2. 在血液层上有絮状沉淀,某些链球菌在沉积的红细胞表面上,会有小的“棉球样”生长。
3. 肉汤内出现浑浊生长。
4. 肉汤表面有薄膜生长。
5. 出现溶血。
6. 产生气体,许多发酵菌可产气,梭菌属会产生大量的气体,出现明显的溶血现象。
7. 血液层表面或深层有白色颗粒。
8. 液体培养基凝固。

      如果怀疑血培养阳性,应立即进行革兰染色,以无菌手续从培养瓶中取肉汤2~3滴涂片,自然干燥,加热固定并染色。染色结果应尽快报告,如革兰阳性球菌为成对或成堆或成链,革兰阴性杆菌为小杆菌或球杆菌等。革兰染色结果可指导医生为患者经验选择抗生素治疗,并作为实验室进行细菌鉴定补充试验的参考依据,它对于鉴别葡萄球菌和链球菌非常有用。如果血培养阳性革兰染色未发现细菌,应做吖啶橙染色进行二次镜检,这对检测弯曲菌菌血症和布鲁菌菌血症很有帮助,而革兰染色很少发现这些细菌。依据细菌革兰染色形态特点,选择适当的培养基传种,见表1。

      表1。  血培养阳性后根据革兰染色特点应传种培养基种类的建议
染色特点 5%~10%CO2孵育   厌氧气体孵育
血琼脂 巧克力琼脂 中国兰或麦康凯或EMB 血琼脂 PEA或CAN
革兰阳性  
球菌 × × ×
杆菌 × × ×
革兰阴性
球菌 × × × ×
杆菌 × × × × ×
真菌b × ×
持续检测阳性 × × ×
革兰染色阴性c            
a所有培养至少至48h;EMB;伊红美蓝琼脂;PEA;苯乙基醇琼脂;CAN;多粘菌素-萘啶酮酸琼脂。
b增加真菌培养基(如:沙保弱葡萄糖琼脂)和30℃培养。
c接种硫羟乙酸盐肉汤中。

      当革兰染色显示细菌形态均一时,厌氧培养的价值不大。对所有培养阳性,革兰染色阴性的血培养瓶,再次上机检测之前都应传种厌氧和需氧培养皿。
革兰染色为纯的细菌,可进行初步鉴定并做直接抗生素药敏试验的标准程序,而且没有经FDA批准的市售产品。可用于初步鉴定的商品试剂,包括:胆汁溶解,DNA酶,乳胶凝集分型实验等。

      美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的抗生素敏感试验没有血培养直接敏感试验法。然而,许多学者提出:根据革兰染色初步分析鉴定,可以灵活地选择抗生素进行直接抗生素药敏试验。

      对各种血培养法中的阳性肉汤培养物进行传种并且立即孵育培养,为进一步试验用,传种5h-7h后有明显的菌落生长,取琼脂表面的菌落用于细菌鉴定和抗生素敏感试验。使用含固体培养基的血培养系统,如:双相法,有菌落生长可直接进行细菌鉴定和标准的抗生素敏感试验。

     尽管现在使用探针杂交和DNA扩增技术可以鉴定血培养中的细菌和检测抗生素敏感性,但这种技术不实用,价格昂贵,FDA不推荐常规使用。

      血培养分离的细菌,万一需要进一步的研究,至少保存几个星期。为了让细菌活着,兼性需氧菌和兼性厌氧菌应传种到半固体培养基中,例如动力培养基。严格厌氧菌应保存到无葡萄糖的肉汤培养基或冷冻在兔血或脱脂牛奶培养基中。柯养菌可以接种到巧克力琼脂斜面上并用矿物油封存。为长期储存,细菌可悬浮于15%甘油肉汤中并-70℃冷冻。

     血培养阳性结果的报告程序:

      血培养阳性结果十分重要,应立即口头报告给患者的主治医生,报告的日期和时间以及接受报告人的姓名应记录在患者的报告单上。应向临床医师提供重要的信息,包括革兰染色的形态,血培养阳性的数量和其他的鉴定资料,如革兰阳性球菌可疑为葡萄球菌。处理报告之前,应回顾一下患者近期标本的培养情况,这些结果有助于解释感染微生物来源。口头报告后应立即进行书面初步报告。除非初步报告有错误或新发现可改变患者的治疗方案,否则不应更改初步报告的结果。

      当培养24h和48h后,对阴性血培养结果在最短的时间内发出初步报告。有些实验室以培养的时间长短发初步报告,例如:“血培养3天后无细菌生长”。

      血培养检测  真菌培养:

      多种方法可提高血液中真菌的检出率,包括使用通气的真空血培养瓶、双相培养基、裂解-离心技术和特殊营养的肉汤培养基(如脑心侵液肉汤等)。裂解-离心技术是一种分离真菌的有效方法,特别是对于营养要求可可的双相真菌。实际上,大多数需氧的血培养瓶(通常孵育5至7天)可提供充足的营养支持白色念珠菌的生长。然而对于其他念珠菌属、光滑球拟酵母菌、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌和其他双相真菌,使用裂解-离心技术可获得最高的检出率。霉菌抑制琼脂、脑心侵液琼脂和巧克力琼脂通常与lsolator管结合使用。对于分离糠秕鳞斑霉,可在培养基表面覆盖一层橄榄油或其他长链脂肪酸。阴性的真菌血培养应于22-30℃孵育4周后再仍弃。

摘自:《血培养检测规范化操作》,主编:徐英春、倪语星、王金良,上海科学技术出版社

(责任编辑:sgx)

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