您当前所在位置: 首页 > 检验医学 > 微生物 > 正文

血红蛋白电泳检查

日期:2018-12-04 10:58:57 来源:中华检验医学网 点击:

1. 原理
      血红蛋白是由两对多肽链组成的复杂分子。每一条链含有血红素和络合铁原子的卜啉。所有血红蛋白的血红素部分都是相同的。所测定的血红蛋白的蛋白部分称之为珠蛋白。正常人血红蛋白多肽链包括α、β、δ和γ。血红蛋白的结构、分子特性取决于形成其肽链的氨基酸顺序和性状。氨基酸不同可形成不同的血红蛋白,其表面电荷不同,在电场中的泳动率不同。本实验在碱性(PH=8.60)条件下,以琼脂糖凝胶电泳的方法进行,对红细胞洗涤后造成溶血,电泳分离血红蛋白后以氨基黑染色。多余的染色液用酸性液体洗去。待琼脂糖凝胶板干燥后,肉眼可直接判别有无电泳条带异常。运用光密度扫描仪检测准确定量分析电泳条带异常情况。血红蛋白异常有二种类型:血红蛋白性质或结构的异常称之为血红蛋白病。血红蛋白中的一条链合成减少引起血红蛋白性质异常,称之为地中海贫血。
2. 标本采集
2.1 标本采集前病人准备:受检者应空腹。
2.2 标本种类:抗凝血
2.3 标本要求:抗凝剂选用EDTA,柠檬酸或肝素均可,避免碘乙酸。常规静脉采血1.8ml,加入含有109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml的干燥。清洁试管中,充分混匀。
4. 标本储存:储存于2-8℃冰箱中,5天。
5. 标本运输:储存于2-8℃状态下的冰壶或泡沫箱密封运输。
6. 标本拒收标准:细菌污染、溶血或脂血标本不能作测定。
7. 试剂
7.1 试剂名称:血红蛋白电泳检查试剂
7.2 试剂生产厂家:法国Sebia公司
7.3 包装规格:150tests
7.4 试剂盒组成
琼脂糖凝胶  10块                 溶血素  1瓶
缓冲液条带  10包×2条             薄滤纸  1×10张
氨基黑(浓缩液)1瓶×100ml         点样模具滤纸  10条×1盒
7.5 试剂储存条件及有效期:贮存于室温(15~30℃)或冰箱(2~8℃),不能冷冻。有效期两年。
8. 仪器设备
8.1 仪器名称:SEBIA电泳仪
8.2 仪器厂家:法国Sebia公司
8.3 仪器型号:HYDRASYS
9. 操作步骤
9.1 血红蛋白液制作:抗凝血离心,5000rpm,5分钟,去掉血浆,用10倍体积的生理盐水洗涤红细胞3次,若红细胞体积小于10ul,需特别小心。取10ul红细胞加入130ul溶血液造成溶血。震荡混匀10秒钟,室温下培育5分钟待测。
9.2 启动电泳仪
9.3 将加样器放在一平板上,有数字的一端向上。各加样孔加入10ul溶血的样品,2分钟内加样完毕。将加样器放入保湿盒内,齿端向上(转运时用塑料齿保护架)。等待5分钟,使样品扩散至齿端。打开电泳仪盖,抬起电极和加样器支架。
9.4 使用HYDRAGEL 15 HEMOGLOBINCE时选择仪器的“HBTOTAL”程序(位于链盘左侧)。
9.5 从包装袋内取出缓冲条,拿出末端的塑料片,将缓冲条两端塑料片固定在电极支架背侧的钉上,塑料片应紧贴支架。
9.6 取出凝胶板。将薄的滤纸轻轻吸去凝胶板表面的多余液体,然后立即丢弃滤纸。在电泳仪温度控制板表面的边线内加200ul蒸馏水或去离子水。凝胶面朝上,放置凝胶板,边缘对齐边线。略略将凝胶弯曲,然后放平,使水均匀分布在凝胶板下面而不含气泡。
9.7 降低支架,使缓冲条不接触到凝胶板。
9.8 从保温盒里取出加样器。取时拿保护框。折断加样器齿端保护框。将加样器放在4号位置。
9.9 关上电泳仪盖子,按下键盘左侧的绿色箭头“START”键,电泳开始。
9.10 凝胶染色扫描
9.10.1 打开盖子
9.10.2 取出并丢弃加样器
9.10.3 升高两个支架,握住塑料端取出并丢弃缓冲条。
9.10.4 打开凝胶托架,平放,将干燥的凝胶片放入两层间,然后关上托架。
9.10.5 将凝胶支架放入染色池
9.10.6 取出凝胶支架,打开盖子,取出干燥的凝胶片。
9.10.7 在光密度仪的570nm处或以黄色滤光片扫描测定。使用HYDRYS,DVSE或PREFERENCE光密度仪时,使A2片段的标记置于扫描板5mm的标志处。
10. 结果判断与参考范围
扫描得到的只是每种血红蛋白条带的相对浓度值。取出胶片后,首先清洁胶片的背面。判断溶血液的浓度是否合适,主要看基质带的浓度,如基质带浓度过淡,说明溶血液的浓度太淡。正常时A2浓度大约为基质带浓度的1-2倍。
半岁-成人:HbA≧94.5﹪,HbF﹤2.0%,HbA2﹤3.5%
1个月:HbA 12-40﹪,HbF 60-93%,HbA2 0.1-1.0%
6个月:HbA 86-98﹪,HbF 0.84-10.7%,HbA2 0.87-2.9%
脐带血:HbA 4-40﹪,HbF 30-96%,HbA2﹤1.0%
11. 质量控制
建议测定每一批样本时都附有一控制品或含有血红蛋白A,F,C和S的血样本。
12. 临床意义
12.1 检测β-地中海贫血
12.1.1 轻型:HbA2轻度升高,大多在4%-8%
12.1.2 中间型:HbA1A2缺如,HbF可达10%
12.1.3 重型:HbF:30%-90%,HbA多低于40%或甚至0%
12.2 检测α-地中海贫血
12.2.1 标准型α-地中海贫血:新生儿期HbBart′s可达5%-15%,几个月后消失。经煌焦油蓝温育后,少数红细胞内有H包涵体。血红蛋白电泳无异常发现。
12.2.2 血红蛋白H病:HbH在PH8.6或8.8电泳时,向阳极方向移动,泳速快于HbA;在PH6.5电泳时,仍向阳极方向移动。
12.2.3 血红蛋白Bart胎儿水肿综合症:Hb Bart′s占80%-100%,可有少量HbH。HbA、A2及F均缺如。
12.3 检测血红蛋白病:引起临床注意的异常血红蛋白有四种:S,C,E和D。
12.3.1 血红蛋白S:在碱性缓冲条件下血红蛋白S的条带位于A和A2片段之间
12.3.2 血红蛋白C:在碱性缓冲条件下血红蛋白C,E和A2的条带重叠在一起。若这一片段﹥15%,应怀疑有血红蛋白C或E的异常。
12.3.3 血红蛋白E:与血红蛋白C不同的是,E在酸性凝胶电泳中不与A2分离。
12.3.4 血红蛋白D:在碱性缓冲条件下,血红蛋白D和S的条带重叠在一起,但D在酸性凝胶电泳中不与A2分离。
13. 操作性能:灵敏度高、特异性强、操作简便,重复性好。
14. 注意事项:
14.1 试剂贮存于室温(15~30℃)或冰箱(2~8℃)内,不能冷冻。
14.2 不要应用溶血标本
14.3 若检测到异常血红蛋白,而又与常见的异常血红蛋白S,C,D或E不同,可使用其他方法(如球蛋白链电泳)检测,或求助于有关专门实验室。
14.4 HbF小于全部血红蛋白的2%-3%时,扫描检测HbF(或其它一些较少见的血红蛋白)只是半定量的,结果不十分准确。
14.5 对于中度或重度贫血的病例,点样量应增大为15ul或20ul,其结果不受影响。
14.6 电泳过程中不能打开盖子。在染色脱色以及干燥过程中,仪器的一些程序处于锁定状态。
14.7 最后染色后立即扫描测定。若欲保存,可用一保护物覆盖后置于干燥、暗处,避免受热,可保存约3个月。
 

(责任编辑:sgx)

相关阅读

站内搜索

品牌推荐

更多 >>

关闭二维码
关闭二维码