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浅谈自制质控品

日期:2017-09-23 17:17:10 来源: 检验视界网 作者:沙文彬 点击:

    在检测患者标本前,预先检测各种质控品,通过对质控结果的统计学分析,发现检测系统中可能存在的各类误差,并加以纠正。这是现代临床实验室中,保证检验结果可靠性的最重要和最核心手段。

    而质控品则是此质量控制过程中最关键的一环。现在的实验室一般都是购买商品质控物。但此类物质多被一些大厂商所“垄断”,售价高昂;加之一台仪器上,往往需要使用多种类别的质控品,导致质控成本居高不下。据报道,质控成本竟然会占到实验室总成本的22%![1] 因此,对一些资源有限的小检验科来说,进行室内质控,往往是心有余,而力不足。

    同时,各地如今都在一再压低检验项目的收费。因此,如何在保证检验质量的前提下,进一步控制成本,也是每一个检验人需要面对的现实挑战。

    此外,质控品理论上应与患者标本具有相同的基质(matrix)。[2] 但是,商品质控物往往是对人血清或血浆经过了非常复杂的处理。比如,添加氯化钙和凝血酶、去除β脂蛋白、添加各种稳定剂和保护剂、添加外源性分析物、冻干等过程,使其最终的成分与新鲜血清存在很大差异。[3] 而很多商品质控物,甚至都不是以人血清为原料,而是使用动物血清制备的,其与新鲜人血清在组成上更是大相径庭。

    因此,这些商品质控物在实际检测中,难免与新鲜患者血清存在表现上的差异,不利于真正检出误差。但是,在商品质控物的说明书上,对其组成、各种添加物、局限性、基质效应等视若机密,往往只字不提。

    而混合患者血清则是一种易得、零成本、几乎不存在基质效应的质控物。其在使用前无需复溶,应用便捷;由此也避免了冻干商品质控物在复溶时,因加液体积不准确而产生的质控结果偏差。所以,理论上混合血清是最天然和最理想的质控品。

    检测完的患者标本,往往都被视作医疗垃圾,废弃处理掉了。但是,将其中的血清收集、制备为质控品,真可谓“变废为宝”。回想多年前检验科所用的质控品,也都是自制混合血清之类,但后来却完全被商品质控物“霸占”。基于上述商品质控物应用过程中的诸多不便和弊端,it is the time to re-constitute our controls!(是时候去重建我们的质控品了!)

    下面就是笔者以混合患者血清作为质控物的一点经验。当然此过程都是自己摸索着进行的,所以其中必然有很多不足和错误,还请大家指正。

    以下的混合血清,最初是为我们电化学发光分析仪上的甲功五项(T3、T4、FT3、FT4和TSH),肿瘤标志物(AFP、CEA、CA125、CA19-9、CA72-4、CA15-3、NSE、Cyfra21-1、TPSA、FPSA和HCG), 贫血三项(Ferr、Folate和B12)等项目制备的。但后来发现,将其用于另一厂商的化学发光仪上,作为性激素六项(Testo、Prog、E2、PRL、FSH和LH)、糖尿病两项(Insulin和C肽)、甲状腺自身抗体(Anti-Tg和Anti-TPO)、甲状腺球蛋白(Tg)和甲状旁腺激素(PTH)的室内质量控制也很适用。

    假设以上项目均采用商品质控物的话,则需要至少五种以上不同种类的质控物。因此可以说,笔者自制的质控品是一份“超级复合血清质控品”。其制备步骤如下:

    1.在决定制备混合血清前一个月开始,在日常工作中注意搜集一些项目的 “超高值”患者血清,比如CEA>500 ng/mL、TPSA>100 ng/mL、CA72-4>300 U/mL,Cyfra21-1>50 ng/mL等。将这些超高值血清吸到子弹头(Eppendorf 管)中,在-20度冷冻保存起来(每个项目收集一到两份血清即可)。

    因为这些项目,大多数患者的检测值都是正常或偏低的,高值的较为罕见(当然,这是笔者医院的患者类型决定的,不同医院间会可能会有较大差异)。如果不特别添加超高值血清,最终混合血清中这些项目的浓度会太低,不利于检出误差。

    2.在确定制备混合血清几天前,将每日检测完的患者标本(血清管)留存下来,冷藏于冰箱中。注意剔除其中外观异常的标本,如溶血、脂血和严重黄疸等。同时,要留意其中患者的类型分布。比如,如果其中很多标本都是来自孕产妇,则可以剔除大部分此类标本。否则最终混合血清中HCG等的浓度会过高,不利于误差控制。或者如果其中有较多肝癌患者的标本,也可剔除绝大部分,以免最终AFP浓度过高。当然,这些需要根据读者所在医院日常检验的患者类型,以及平常各分析物的浓度分布而定。

    同时,现在的LIS也可统计一段时间内,检测的标本中各分析物的平均值。所以事先也可借助此功能,大致掌握最终混合血清中各分析物的浓度。

    3.准备一个干净的250 mL三角烧瓶(如有条件,可高温烘干)。同时将步骤1中收集的超高值血清从冰箱中取出,让其自然融化。将步骤2中留存标本中的血清,用吸管加到烧瓶中,边加边摇。加至约100 mL后,再将融化了的超高值血清也加到三角烧瓶中,充分混匀。静置半小时左右。

    用吸管去除可能出现的大团纤维蛋白沉淀。再进行简单过滤(或离心),将滤液再次充分混匀,分装到子弹头中。分装完毕,可取最开始和结尾分装的两只子弹头,分别同时检测几个项目,以确定无明显的“瓶间差”(或者可以通过检测电解质项目来确定有无瓶间差,以节省时间和成本[3])。之后将分装好的血清,在-20度冷冻保存。

    4. 第二天,取出几支子弹头,室温自然融化,轻轻颠倒混匀,合并血清。先以原装商品质控物检测各个项目,确定它们都在控后,检测自制混合血清。按标准的做法,应当将混合血清的各个项目测定20次后,再计算出均值和标准差。但是,对于小检验科来说,这种做法显得非常不经济和不实用。

    因此,在资源有限的情形下,可以采用一种“粗糙”的替代策略:将混合血清各个项目检测两次后,取平均值。之后,可按照项目说明书上的精密度数据,选择与混合血清均值最接近浓度下的批间精密度,将其设定为混合血清该项目的的变异系数(CV),再由此推导出标准差。

    以笔者经验,这种替代策略对精密度表现好的检测系统来说,还是很适用的。但对于精密度不好的检测系统来说,需要谨慎使用。当然,在条件许可的情况下,还是应该以标准的做法来确定均值和标准差。

    此混合血清的实际应用中,还有一些问题需要说明:

    I.在上述患者标本的留存过程中,笔者并未特别剔除乙肝表面抗原阳性等有传染病的标本。但是,只要在混合血清的制备和日常使用中,注意采取普遍性的防护措施(universal precautions)。这些混合血清质控品,并不会比日常患者标本更具危险性。当然,如果条件允许,也可剔除此类标本。

    II.这些混合血清,在开始的两三个月中,融化后外观清亮,与新鲜血清无异。但之后,融化后却出现很多絮状物。这主要是β脂蛋白在长期冻存后变性导致的。但是絮状物的出现,对电化学发光中各个项目的浓度值,都未见任何影响。

    同时,絮状物出现前后,此混合血清(未离心)在生化仪检测血脂等项目,其浓度也无明显变化。但在实际应用中,可以对出现混浊的自制质控品,在普通离心机上离心数分钟后,吸取中间层较为清亮的血清,用于(电)化学发光检测。

    III.为了最大限度的避免基质效应,上述混合血清的制备中,并未加入任何防腐剂、稳定剂等。但是经过两个批次、最长八个月的连续观察,发现电化学发光的19个项目中,绝大多数都是十分稳定的。比如,TSH(均值3.20 mIU/L)在八个月中累计CV仅为2.08%。

    只有两个项目在-20度是不稳定的,分别是叶酸和NSE。而文献报道也证实了这一点。[4][5] 不过在-20度,叶酸的浓度在第一个月中会逐步下降,随后在第二个月到第十二个月中,会保持在一个新的浓度上。[4] 因此,对于叶酸,可以在一个月后重新确定靶值。而NSE还需要进一步确定其变化规律。

    此外,文献中报道乙二醇或甘油,可作为质控品的稳定剂和保护剂。[6] 因此,对于叶酸和NSE,或许可以单独制备一份混合血清,在其中添加乙二醇,以增强它们的稳定性。对此,笔者正在试验中。

    当然,如果读者的实验室有-70度左右的冰箱,那就再好不过了。不仅叶酸和NSE的稳定性不再是问题,而且生化中的很多酶类项目,在此温度也十分稳定,可直接制备混合血清用于生化项目的室内质控。

    IV.用上述方法制备的混合血清,其绝大多数项目的浓度值都是正常,或轻微偏高的。要想获得高值的混合血清,有两种方法可以考虑。

    一种是制备一定量的混合血清,不要分装,直接置于稍大的塑料瓶中,在-20度冷冻一天。随后将塑料瓶置于4度的冰箱冷藏室内,让其中的血清缓慢自然融化,期间切勿摇动。待血清刚刚融化后,用吸管小心吸出瓶中上半部分的清液,此时瓶中所剩的另一半血清就是浓缩的了。[7] 不过,以笔者的试验,此方法对肿瘤标志物和激素等的富集作用有限,倒是比较适用于制备高浓度的生化质控血清。

    因此,对于电化学发光仪所用的高值(或者说水平2)混合血清,可采用下面的第二种方法。在约一个月的时间内,每日工作结束后,收集当日符合“特定条件”的血清,加到一个固定的瓶中,冷冻储存,如此反复。特定条件可以设定为,比如:明显甲亢的血清,HCG 1000-5000 IU/mL,AFP 100-1000 IU/mL,CEA>100 ng/mL, TPSA>10 ng/mL , Ferr<30 ng/mL等等。在收集到一定量后后,将全部血清解冻,充分混匀。初步检测其浓度,如浓度过高,可加入一定量的正常血清调节。

    采用相似方法制备混合患者血浆作为凝血(PT、APTT、Fbg、DD和FDP)质控品。经过几个批次,最长约三个月的应用,结果也十分令人满意。

    参考文献
[1] G S Cembrowski, M A Cervinski. Demystifying reference sample quality control. Clin Chem, 2016, 62: 907-909.
[2] 冯仁丰 主编. 临床检验质量管理技术基础, 第2版. 上海:上海科学技术文献出版社,2007. 229-230.
[3] A Eto, A Shiki, Y Chikaura, et al. Multienzyme control serum (Seraclear-HE) containing human enzymes from established cell lines and other sources. 1: Preparation and properties. Clin. Chem. 1995, 41:872-880.
[4] E H J M Jansen, P K Beekhof, J W J M Cremers, et al. Long-term (in)stability of folate and vitamin B12 in human serum. Clin Chem Lab Med, 2012, 50:1761–1763.
[5] D W Mercer, M A Virji, G E Barry, et al. New solid-phase enzyme immunoassay of neuron-specific enolase in serum: effect of storage, temperature, lipemia, icterus, and hemolysis. Clin Chem, 1990, 36: 1519.
[6] P Premachandra, P L Wood, P G Hill, et al. Preparation and stability of low-cost liquid quality-control serum stabilized with ethanediol. Clin Chem, 1987, 33: 851-852.
[7] G Letellier, F Desjarlaisa. A simple procedure for the preparation of concentrated sera. Clin Biochem, 1985, 18: 267-271. 

(责任编辑:zqg)

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